产纤维素酶细菌的分离、鉴定与酶学性质研究

梁倩，李荷，王卓娅

(广东药科大学 1.生命科学与生物制药学院； 2.药学院，广东 广州 510006)

作为植物光合作用的主要产物，纤维素是自然界含量最多、分布最广、最易得的可再生有机资源[1-2]。遗憾的是，除少量用于堆肥外，大部分纤维素资源被直接丢弃或就地焚烧，不仅未能得到有效利用，而且对环境造成污染[3-4]。纤维素的开发利用，对于解决目前人类面临的环境污染和资源衰竭危机，均具有十分重要的意义[5-6]。

纤维素结构的难以破坏性，是实现纤维素资源有效利用的最大壁垒[7]。通过微生物产生的纤维素酶催化降解纤维素，是纤维素处理最为经济环保的方法[8-10]。筛选纤维素酶高产菌株，降低高效纤维素酶生产成本，则有望从源头解决纤维素资源的开发利用难题。本研究从中药堆肥渣和黑龙江玉米地样本中，筛选高产纤维素酶菌株，对其进行分子生物学鉴定和酶学性质分析，以期为纤维素酶制剂研制或基因工程菌株的构建提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品

广州凉茶中药渣堆肥，黑龙江玉米地地下8 cm土壤。

1.2 试剂

葡萄糖标准品、羧甲基纤维素钠(sodium salt of carboxyl methyl cellulose，CMC-Na)等常规试剂均为国产分析纯；胰蛋白胨、酵母提取粉、琼脂粉购于Coolaber公司；2×TSINGKE Master Mix、琼脂糖、微生物基因组DNA提取试剂盒购于Tsingke公司。

1.3 培养基

初筛培养基(CMC-Na固体培养基，200 mL)：蛋白胨2 g，酵母粉2 g，CMC-Na 2 g，NaCl 1 g，KH2PO40.2 g，琼脂粉3 g，121 ℃高压灭菌20 min。刚果红鉴别培养基(200 mL)：(NH4)2SO40.4 g，MgSO40.1 g，K2HPO40.2 g，NaCl 0.1 g、CMC-Na 4 g，刚果红0.08 g，琼脂粉3 g，121 ℃高压灭菌20 min。复筛培养基(CMC-Na液体培养基)：CMC-Na固体培养基不加琼脂粉。

1.4 样品处理

称取样品10 g，加入到盛有90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，充分打散混匀后，置于28 ℃恒温摇床180 r/min震荡20 min，得10-1稀释菌液。无菌操作吸取100 μL 10-1稀释菌液至盛有900 μL无菌水的1.5 mL EP管中，吹打混匀得10-2稀释菌液。照此方法依次制备10-3和10-4浓度稀释菌液。

1.5 初筛

吸取10-2、10-3、10-43个梯度的稀释菌液100 μL，分别涂布于CMC-Na固体培养基上，每个稀释度设3个重复。28 ℃恒温倒置培养，每天观察挑选，将长出的较大菌落点种于刚果红固体培养基上，培养3～10 d观察有无水解圈形成。

1.6 纯化和复筛

有水解圈形成的菌落，经重复划线分离得单菌落。观察单菌落形态大小，将目测为不同菌种的单菌落，分别点种于CMC-Na固体初筛培养基，每个菌种重复点种3个点。28 ℃恒温培养5 d后，每培养皿加入1 mg/mL刚果红染色液15 mL，染色1 h后弃去染液，加入1 mol/L NaCl水溶液15 mL脱色1 h。测量菌落直径(d)，水解圈直径(D)，并计算D/d值。

1.7 纤维素酶酶活测定

将复筛获得的较优菌株接种于5 mL复筛液体培养基中，28 ℃ 180 r/min振荡培养5 d，测定各菌株的纤维素酶活力，每组酶活力重复测定3次取平均值。3,5-二硝基水杨酸法(3,5-Dinitro salicylic acid,DNS)葡萄糖标准曲线的绘制方法、羧甲基纤维素酶(carboxymethylcellulase，CMCase)的酶活测定方法、滤纸纤维素酶(filter paper cellulase，FPase)的酶活测定方法，以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，βGase)的酶活测定方法见参考文献[11]。

1.8 分离菌株的16S rDNA序列分析与鉴定

待鉴定菌株于CMC-Na液体中培养过夜后，使用微生物基因组DNA提取试剂盒提取基因组总DNA为模板，采用27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3′)引物扩增16S rDNA序列，PCR扩增体系和反应条件见参考文献[12]。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若大小与预期结果相符，送广州擎科生物技术有限公司测序。经双相测序拼接所得结果，在NCBI上进行Blast相似性搜索，获取近似典型菌株基因序列，进行菌种鉴定，同时使用MEGA 5.0 软件生成系统发育进化树。

1.9 分离菌株所产纤维素酶性质分析

温度对酶学活性及稳定性的影响：测定下列温度条件下(4 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)粗酶液的酶学活性和稳定性。所有反应均在pH4.8条件下进行，具体实验方法见参考文献[13]。

pH值对酶学活性及稳定性的影响：在50 ℃条件下，测定pH 2～11反应体系中粗酶液的酶学活性和稳定性，具体实验方法见参考文献[13]。

不同金属离子对酶学活性的影响：将粗酶液经2个浓度(1、10 mmol/L)的11种金属离子(Ca2+、Cu2+、Hg2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Ni2+以及Li+)处理4 h后，50 ℃条件下测定其酶学活性，以未处理粗酶液为100%参照。

不同有机溶剂对酶学活性的影响：将粗酶液经3个浓度(1%、15%、30%)的5种有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、DMSO、Triton X-100)处理4 h后，50 ℃条件下测定其酶学活性，以未处理粗酶液为100%参照。

耐盐性研究：将粗酶液经6 个浓度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L)钠盐处理4 h后，50 ℃条件下测定其酶学活性，以未处理粗酶液为100%参照。

2 结果

2.1 产纤维素酶菌株的获得与酶活测定

筛选获得纤维素酶高产菌株3株，分别命名为Z-1、Z-2和H-3。3菌株的菌落形态与刚果红水解圈结果如图1所示，菌落直径(d)、刚果红透明圈直径(D)与D/d值见表1。

图1Z-1、Z-2、H-3菌株的菌落形态及刚果红水解圈

Figure1Colonial morphologies and Congo red transparent circles of Z-1,Z-2 and H-3 strains

以不同含量葡萄糖为横坐标，其570 nm处的吸光度值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，R2为0.999 4，线性拟合良好(图2)。CMC-Na液体培养基培养5 d后的酶学活性见表2，其中H-3菌株CMCase酶学活性高达(1 538.44±16.49) U/mL。

表1 Z-1、Z-2、H-3菌株在CMC-Na固体培养基上的菌落直径、刚果红透明圈直径及比值

Table1Colony diameters,Congo red transparent circle and their ratios of Z-1,Z-2 and H-3 strain

菌株编码采集处清晰度d/cmD/cmD/dZ-1中药渣清晰3.435.431.58Z-2中药渣清晰1.834.862.66H-3黑龙江土壤清晰2.154.882.27

1.00.80.60.40.20.00.00.40.81.21.62.02.42.8葡萄糖含量/mgAY=0.2804X-0.006583R2=0.9994

图2葡萄糖标准曲线

Figure2Glucose standard curve

表2 各菌株在CMC-Na液体培养基培养5 d的酶学活性

Table2Enzymatic activity of three strains in 5-d CMC-Na culture

菌株编码CMCase/(U·mL-1)FPase /(U·mL-1)βGase/(U·mL-1)Z-1977.92±17.97128.38±11.8952.06±7.14Z-21 089.79±7.43191.15±7.9376.46±5.74H-31 538.44±16.49212.87±8.8186.58±8.98

2.2 菌株的基因鉴定

提取Z-1、Z-2、H-3基因组DNA，分别扩增16S rDNA区域，并对PCR产物电泳检测，发现1 600 bp附近可观察到清晰条带(图3)。将3菌株16S rDNA序列在Gen-bank中作同源性检索分析，发现与已注册参考菌株16S rDNA序列同源性高于99%，H-3和Z-2菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，Z-1菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)(图4)。

2.3 最佳发酵时间测定

H-3和Z-1菌株最佳发酵时间为5 d，Z-2菌株最佳发酵时间为7 d(图5)。

1234520001000750500250100bp1. DNA marker; 2. 阴性对照; 3. H-3; 4. Z-2; 5. Z-1。图3 Z-1、Z-2、和H-3菌株的16S rDNA PCR扩增图Figure 3 Electrophoresis for 16S rDNA amplification of Z-1,Z-2 and H-3 strains

Bacillusvallismortis(AB021198)Bacillussiamensis(GQ281299)Bacillusmethylotrophicus(LLZC01000010)Z-1Bacillussubtilissubsp.InaquosorumKCTC13429(AMXN01000021)Bacillussubtilis(AJ276351)H-3Z-2Bacillustequilensis(HQ223107)Bacillussubtilissubsp.spizizenii(AF074970)Bacillushalotolerans(DQ993671)Bacillusmojavensis(AB021191)0.002Bacillusgobiensis(KF995513)

图4Z-1、Z-2、和H-3菌株的16S rDNA系统发育树

Figure4Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of Z-1,Z-2 and H-3 strains

100806040200CMC-Na相对酶活/%1002468培养天数/dZ-2菌株H-3菌株Z-1菌株

图5酶活随菌株培养天数的变化曲线

Figure5Change curve of enzyme activity with the number of days of strain culture

2.4 温度对菌株所产纤维素酶活性及稳定性的影响

pH4.8反应条件下，3株菌株所产纤维素酶的最适温度均为50 ℃。50 ℃热处理4 h后，相对剩余酶活均保持在50%以上(图6)。

2.5 酸碱度对菌株所产纤维素酶活性及稳定性的影响

Z-1菌株所产纤维素酶最适pH值为pH4，H-3和Z-2菌株所产纤维素酶的最适pH值为pH5；pH 4～6之间时，H-3和Z-2菌株所产纤维素酶经4 h处理后，酶活反而升高，最高为122%(图7)。

2.6 金属离子对菌株所产纤维素酶活性的影响

10 mmol/L Ag+离子对3株菌株所产纤维素酶活性均表现出显著的激活作用；1 mmol/L Co2+离子和1 mmol/L Mg2+离子对Z-2菌株所产纤维素酶活性有显著激活作用，1 mmol/L Fe2+离子对H-3菌株所产纤维素酶活性具有显著激活作用；10 mmol/L Hg2+离子和10 mmol/L Mn2+离子则对H-3和Z-2菌株所产纤维素酶活性表现出显著抑制作用(图8)。

2.7 有机溶剂对菌株所产纤维素酶活性的影响

Tris-100对3株菌株所产纤维素酶活性均表现出显著的激活作用；低浓度甲醇和DMSO对Z-1和Z-2菌株所产纤维素酶活性表现出显著激活作用；而高浓度的甲醇、乙醇和异丙醇，则对3株菌株所产纤维素酶活性表现出强烈抑制作用(图9)。

相对酶活/%100806040200204060800θ/℃204060800θ/℃204060800θ/℃H-3Z-1Z-2温度稳定性最适温度100806040200100806040200

图6温度对菌株所产纤维素酶活性及稳定性的影响

Figure6Effect of temperature on enzyme activity and stability

H-3Z-1Z-2相对酶活/%1201008060402000246810pH0246810pH0246810pHpH稳定性最适pH120100806040200120100806040200

图7pH对粗酶液的酶学性质影响

Figure7Effect of pH on enzymatic properties of crude enzyme solution

H-3Z-1Z-2相对酶活/%16012080400Ca2+Cu2+Hg2+Fe2+Co2+Mg2+Li+Zn2+Ni2+Ag+Mn2+金属离子24020016012080400160120804001mmol/oL10mmol/oLCa2+Cu2+Hg2+Fe2+Co2+Mg2+Li+Zn2+Ni2+Ag+Mn2+金属离子Ca2+Cu2+Hg2+Fe2+Co2+Mg2+Li+Zn2+Ni2+Ag+Mn2+金属离子

图8金属离子对粗酶液的酶学性质影响

Figure8Effect of metallic ions on enzymatic properties of crude enzyme solution

H-3Z-1Z-21%15%30%相对酶活/%140120100806040200Tris-100DMSO异丙醇乙醇甲醇有机溶剂(V/V)Tris-100DMSO异丙醇乙醇甲醇有机溶剂(V/V)Tris-100DMSO异丙醇乙醇甲醇有机溶剂(V/V)140120100806040200140120100806040200

图9有机溶剂对粗酶液的酶学性质影响

Figure9Effect of organic solvents on enzymatic properties of crude enzyme solution

2.8 盐浓度对菌株所产纤维素酶活性的影响

H-3和Z-1菌株所产纤维素酶在NaCl浓度为2.5 mol/L时，酶活力保留54%以上；Z-2菌株所产纤维素酶在NaCl浓度为1.5 mol/L时，酶活力保留56.34%，之后随着NaCl浓度的升高，酶活力急剧下降(图10)。

c(钠盐)/(mol?L-1)100806040200CMC-Na相对酶活/%H-3菌株Z-1菌株Z-2菌株0.00.51.01.52.02.5

图10粗酶液的耐盐性

Figure10Salt tolerance of crude enzyme solution

3 讨论

产纤维素酶的菌种很多，细菌由于所产纤维素酶的酶活不及真菌高，在过去未能得到太多关注，之前的研究较多集中在木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)等真菌上[9-10,12,14-15]。近年来，对产纤维素酶细菌的研究日益受到重视[8,13]，这一方面是由于细菌所产纤维素酶具有发酵时间短，发酵条件易于控制，酸碱耐受性强，最适反应温度范围广等优点。另一方面则由于污物纤维素类的分解大多在缺氧环境下进行，不利于真菌生长。

堆肥中，秸秆的降解离不开纤维素酶的参与[16]，因此，本研究以广州凉茶中药渣堆肥为筛选样本之一。选取黑龙江玉米地土壤为筛选样本，则是由于微生物资源最为丰富的土壤环境，是纤维素酶高产菌株的重要来源[17]。

16S rDNA基因序列分析鉴定发现，3株菌均为芽孢杆菌。芽孢杆菌为目前研究最多的产纤维素酶细菌[6,18-21]，其中，吴文韬等[6]2013年获得的枯草芽孢杆菌，以及吴自祥等[21]2017年获得的解淀粉芽孢杆菌(P.amyloliquefaciens)表现出较高的纤维素酶活性，CMCase酶学活性分别为153.84 U/mL和240.31 U/mL。与国内报道的这些高酶活菌株相比，H-3、Z-1和Z-2所产纤维素酶活性更高，其中H-3菌株CMCase酶学活性高达1 538.44 U/mL，对其进行优化和诱导，进一步提高纤维素酶活力，具有较高的理论价值和较好的应用前景。

对3株菌株所产纤维素酶的酶学性质分析发现，所产纤维素酶均耐热、耐酸、耐盐，H-3和Z-1菌株所产纤维素酶对有机溶剂亦表现出一定的耐受性，这些特征有利于纤维素酶的工业化生产和使用。此外，3株菌株所产纤维素酶可被Ag+、Co2+等金属离子激活的特点，则可用于酶学活性的提高。

下一步将进一步优化菌株发酵工艺，同时筛选并克隆纤维素酶相关基因，进行基因工程菌的构建。