波形蛋白在卵巢子宫内膜样腺癌组织中的表达及临床意义▲

张 勇 孙广男 康 晶 覃雅倩 银 铎

(中国医科大学附属盛京医院第二微创妇科，辽宁省沈阳市 110004，电子邮箱：yonger20120817@126.com)

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，也是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，70%～80%的病例在诊断时已为晚期，患者的5年生存率仅为30%～40%[1]。卵巢子宫内膜样腺癌(ovarian endometrioid adenocarcinoma，OEA)发病率较低，仅占卵巢全部肿瘤的2%，占上皮性卵巢癌的16%～25%[2]。OEA组织病理学特点和子宫内膜癌相似，临床表现缺乏特异性，患者在确诊时往往已发展到中晚期，且在治疗后期难以突破对化疗药产生耐药性的“瓶颈”，因此患者的临床预后较差，死亡率较高。波形蛋白是一种Ⅲ型中间丝蛋白，目前已被证实在多种肿瘤组织中异常高表达，与肿瘤患者的临床病理特征和预后密切相关，其作为一种生物学标志物已被广泛用于多种肿瘤的临床诊断及预后的评估[3-6]。但目前关于波形蛋白在OEA组织中表达的研究鲜有报道。本研究运用免疫组化法分别检测正常卵巢、卵巢子宫内膜异位症、卵巢交界性子宫内膜样肿瘤和OEA组织中波形蛋白的表达水平，旨在探讨波形蛋白在OEA的发生发展和侵袭转移中的作用，及其与OEA患者临床病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2011年1月至2015年12月在我院诊治的110例妇科患者的卵巢肿瘤或正常卵巢组织，其中OEA 40例、卵巢交界性子宫内膜样肿瘤10例、卵巢子宫内膜异位症30例、因宫颈癌而手术切除卵巢且术后病理证实为正常的卵巢组织30例。所有病例均为初发且术前未经任何治疗，所收集组织均为手术切除后经本院病理科确诊的石蜡标本。OEA患者年龄23～78岁，中位年龄49岁，年龄≤50岁18例、>50岁22例；国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期Ⅰ期15例，Ⅱ期9例，Ⅲ期15例，Ⅳ期1例；分化程度：低分化16例，中分化17例，高分化7例；伴淋巴结或远处转移23例，不伴淋巴结或远处转移17例。

1.2 检测试剂与方法 鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(批号：17A10709)、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase，SP)法超敏试剂盒(批号：K175622G)和二氨基联苯胺显色试剂盒(批号：K176614A)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。将收集的标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。将石蜡组织块切成4 μm厚切片，按SP法和抗体试剂盒说明书进行实验操作。切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后用磷酸缓冲盐溶液清洗，孵育后滴加一抗(鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，1∶100)，4℃过夜。滴加100 μl山羊抗小鼠波形蛋白二抗(1∶200；北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K185208D)，37℃孵育1 h。以磷酸缓冲盐溶液代替一抗作为空白对照。应用二氨基联苯胺溶液显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染、树脂封片。

1.3 评分标准[7]在400倍显微镜下随机观察5个视野，以细胞质内出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为波形蛋白阳性细胞，按阳性细胞比例进行评分，无阳性细胞为0分，<10%为1分，10%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；按着色强度进行评分，未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。最终采用半定量计分法判定结果，即将阳性细胞比例和着色强度的评分数相乘计算综合得分，以<3分为阴性表达，≥3分为阳性表达。以上免疫组化染色结果由两位高年资病理医生通过独立双盲法读片评定。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料以例数(百分比)表示，比较采用χ2检验和Fisher确切概率法；采用趋势χ2检验分析波形蛋白阳性表达率与疾病发展程度的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 波形蛋白在4种卵巢组织中的表达情况 波形蛋白主要表达于OEA和卵巢交界性子宫内膜样肿瘤组织的细胞质中(见图1及图2)。在正常卵巢组织、卵巢子宫内膜异位症、卵巢交界性子宫内膜样肿瘤和OEA组织中，波形蛋白的阳性表达率分别为6.67%(2/30)、43.33%(13/30)、60.00%(6/10)、85.00%(34/40)，呈上升趋势(χ2=41.799，P<0.001)。

图1 波形蛋白在OEA组织中的表达(SP法，×400)

图2 波形蛋白在卵巢交界性子宫内膜样肿瘤组织中的表达(SP法，×400)

2.2 不同临床病理特征OEA患者癌组织的波形蛋白表达情况 FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期者、伴淋巴结或远处转移者癌组织的波形蛋白阳性表达率分别高于Ⅰ～Ⅱ期者、无淋巴结或远处转移者(均P<0.05)。不同年龄、分化程度患者癌组织的波形蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征OEA患者癌组织的波形蛋白表达情况[n(%)]

注：*Fisher确切概率法。

3 讨 论

波形蛋白是一种直径约10 nm的Ⅲ型中间丝蛋白，相对分子质量约为57 000，由464个氨基酸残基构成。作为一种结构蛋白，波形蛋白在细胞中形成一个由中央向周围呈放射状的网状结构，将线粒体、核膜和内质网等细胞器锚定在细胞特定的空间，与微丝、微管共同构建起完整的细胞网络结构，对细胞形态完整性的维持有着重要作用。越来越多的研究表明波形蛋白广泛分布于人体多种器官组织，其表达水平的异常升高与肿瘤的发生密切相关，且对疾病的进展有推动作用[8-12]。但其中相关作用机制尚不清楚，目前公认的是波形蛋白能在肿瘤发生侵袭转移过程中促进上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生，而EMT是肿瘤发生进展重要的细胞学基础，可使原有的上皮细胞发生形态学改变并转化成间充质细胞，促进肿瘤发生侵袭和转移[13]。因此，波形蛋白也成为临床上常见的肿瘤生物学标志之一，对患者的临床治疗及预后的评估有着重要的指导意义。

相比于其他肿瘤，波形蛋白在卵巢癌组织中的相关研究起步较晚，且现有的报道多以常见的上皮性卵巢癌(如卵巢浆液性腺癌、黏液性腺癌)为研究对象[14-17]。Li等[14]研究发现相比于良性卵巢肿瘤和交界性卵巢肿瘤，上皮性卵巢癌组织中波形蛋白表达水平上调，能够促进肿瘤发生转移，且其高表达影响肿瘤患者的总生存率和无病生存率。周丹丹等[15]的研究也证实，波形蛋白在上皮性卵巢癌组织中呈高表达，且与临床分期、分化程度和发生淋巴结转移呈正相关，提示波形蛋白还可能与患者的预后情况有关。Kenda等[16]也在卵巢浆液性囊腺癌细胞中发现波形蛋白表达水平异常升高，并在显微镜下观察到该类细胞逐渐失去原有圆形的细胞形态，转变成具有“触手”的间充质细胞，并且由肿瘤组织的表面向深部侵袭，提示波形蛋白促进肿瘤细胞发生EMT可能是上皮性卵巢癌发生侵袭和转移的重要作用机制。

OEA是临床上相对少见的上皮性卵巢癌，因缺乏特异性的临床表现，在疾病早期阶段难以被发现，因此OEA患者的临床治疗效果往往不佳，有较高的死亡率。关于OEA的组织学起源，大多数学说认为其是卵巢子宫内膜异位症的恶变，Huang等[18]报告42%的OEA患者合并卵巢子宫内膜异位症；任芳等[19]也发现50%以上的OEA病例由卵巢子宫内膜异位病灶发生恶变而来。但是目前关于OEA的进展过程及机制的研究鲜有报道。本研究结果显示，正常卵巢组织、卵巢子宫内膜异位症、卵巢交界性子宫内膜样肿瘤和OEA组织中波形蛋白的阳性表达率呈上升趋势(P<0.05)，其在OEA组织中的阳性表达率高达85.00%，且Ⅲ～Ⅳ期者、伴淋巴结或远处转移者癌组织的波形蛋白阳性表达率分别高于Ⅰ～Ⅱ期者、无淋巴结或远处转移者(均P<0.05)，提示波形蛋白在OEA组织中呈高表达，且可能与患者的病情进展、肿瘤转移等有关。由此我们推测波形蛋白的高表达可能参与了OEA的发生发展过程，并促进其侵袭和转移，这与其他类型上皮性卵巢癌的相关研究结论相似。因此，波形蛋白在一定程度上能够辅助对OEA的临床诊断，对患者的预后评估也有一定的参考价值。但不同年龄、分化程度患者癌组织的波形蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，与其他类型上皮性卵巢癌的相关研究结论不一致，这可能与我们的研究病例数较少有关。此外，一项研究结果表明在OEA组织中波形蛋白呈低表达[20]，这与我们的研究结论相悖，提示波形蛋白在OEA组织中的表达情况还存在争议，仍需要大样本进行深入研究。

综上所述，波形蛋白在OEA组织中呈高表达，可能参与OEA的发生发展过程，且与OEA患者的临床预后密切相关。但波形蛋白能否在临床上作为一种协助评估OEA治疗效果和预后的新型生物学指标，仍需扩大样本量进行深入研究。