多囊卵巢综合征模型的构建与分析

□亓妍妍 孟 欣 张 琳 门肖霞 贾新锐 齐万学

多囊卵巢综合征(PCOS)又名Stein-Leventhal综合征，系下丘脑-垂体-卵巢轴功能失调引起的生殖障碍与代谢异常并存的内分泌紊乱综合征。其主要表现为持续无排卵、胰岛素抵抗、高雄激素血症及高胰岛素血症。患者多呈现月经稀发、量少，甚则闭经、不孕而就诊，除此之外还常伴有肥胖、多毛、黑棘皮症及痤疮等，严重的则可能引起乳腺癌、子宫内膜癌和心脑血管等疾病。目前绝大多数PCOS实验都使用大鼠作为理想动物模型[1]，因其规律且较短的动情周期(4～5d)以及价格便宜可以大规模使用，常用的大鼠有SD和Wistar两种。本文集合了近年来多位研究者从不同生理病理学角度、采用不同的造模方法建立的接近人类PCOS某些病情特征的动物模型，现将各种多囊卵巢综合征大鼠模型综述如下。

一、雄激素造模法

(一)丙酸睾丸酮模型。丙酸睾酮(TP)为一类雄激素类药物，而高雄激素表现如多毛、痤疮等都是PCOS的主要临床特征，这就给我们以提示：高雄激素血症会使该疾病的基本内分泌改变，而高雄激素水平也可能是导致PCOS的病因之一。所以丙酸睾酮模型就是通过外源注射高雄激素来达到干扰卵泡的生长成熟，进而出现不排卵的目的。

盛哲津等[2]将脂溶性药物丙酸睾酮溶于中性茶油中，且将5～6日龄雌鼠，随机分组，对照组小鼠皮下注射中性茶油溶液50μL，注射1次，建模组小鼠颈背部皮下注射丙酸睾酮溶液50μL(1mg丙酸睾酮)。NTO组(给予中性茶油的对照组小鼠)及丙酸睾酮处理模型小鼠(PCOS组)均饲养于标准化的SPF级实验动物房内。检测结果显示虽然模型鼠的糖代谢正常，但其基础血糖值较对照组有所升高(P<0.05)，模型小鼠出现阴道上皮细胞持续角化、交配见栓率、妊娠率显著低于对照组，模型组胰岛素水平虽有所升高却与对照组无显著性差异。卵巢卵泡和正常卵巢相比明显成多囊样发育，见囊状扩张卵泡。LH、FSH都处于低水平(<0.1U/L)，血游离睾酮水平较对照组显著升高(P<0.05)，孕酮水平较对照组显著降低(P<0.01)。以上这些结果表明此次建模部分模拟了人PCOS的临床特点，因此，该方法制备的多囊卵巢综合征小鼠动物模型可以应用于不孕症以及多囊卵巢等的实验研究。总体来说该造模方法的优点是模型持续时间长(>3个月)且操作简便，利于临床实验动物的观察。缺点是成模时间不确定，卵巢形态学结果不足以作为成模的依据。

(二)脱氢表雄酮模型。研究发现，大部分PCOS患者多在青春期时便表现出肾上腺分泌雄激素增多，脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)和血清脱氢表雄酮(DHEA)水平升高。推测可能DHEA的升高是导致PCOS的一个重要原因[3]。脱氢表雄酮是睾酮生物合成中的一个中间产物，经△5途径合成睾酮，如通过外源途径提升DHEA水平也可以造成雄烯二酮水平增高，而睾酮及雌酮水平的升高，就会导致卵泡发育停滞，从而发生排卵障碍。

李燕等[4]将大鼠从23日龄开始：对照组皮下注射油剂(注射用茶油，下同)，注射量为0.2mL/100g；造模组每天早晨于颈背部皮下注射脱氢表雄酮溶液(浓度为30mg/mL，注射量为0.2mL/100g体重)，连续注射20d。经检测得知从23～43日龄，SD雌大鼠体重约为50～150g，所以注射液用量应在0.1～0.3mL之间浮动。其结果显示造模组卵巢表现出闭锁卵泡增多、多囊样改变、闭锁卵泡直径明显大于对照组。造模组血清空腹血糖水平、FSH、T及体质量等方面都明显升高(P<0.05)。综上所述，该模型的优点是该法更接近PCOS的发病机制，造模周期相对较短(20d)，解决了丙酸睾丸酮造模时间过长(>3个月)的问题，且重复性较好，能很好地模拟人PCOS卵巢生理和形态学改变，是当今国内外常用的建模方法。但其缺点也在于DHEA的原料药不溶于水，以往文献采用的造模方法均为DHEA溶于注射用油进行皮下注射，但油剂皮下吸收较缓慢进而导致注射部位形成硬结，会影响药物的进一步吸收。由于人PCOS与通过外源注射雄激素所建立起来的动物模型在对治疗的反应、形态及激素改变等许多方面都有很大差别，故停用DHEA后恢复排卵的周期仍有待进一步商榷。

(三)硫酸普拉睾酮钠模型。张娟等[5]用DHEA硫酸钠盐制剂硫酸普拉睾酮钠9mg/100g/日皮下注射23日龄雌性大鼠20d，结果显示经硫酸睾酮钠皮下注射20天后，其卵巢重量显著升高，卵泡的囊性扩张数变多，卵泡内放射冠或卵母细胞逐渐消失，至于颗粒细胞层则变薄甚至消失，其细胞排列呈现松散状态，卵泡膜细胞出现增生；血清E2、T浓度明显增加。说明本实验模型无论从病理学形态变化，还是血清激素水平都与多囊卵巢综合征病人相似，故可作为一种较理想的用于研究多囊卵巢综合征的动物模型。

二、孕激素联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)造模法

该方法是基于Bogovich等[6]在1989年首先采用的模型。国内朱亮等[7]也对其进行了研究，具体造模过程为：选取24日龄SD雌性大鼠，模型组将左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒皮下埋植注入，3mm/只，3d后(27日龄)开始皮下注射人绒毛膜促性腺激素1.5×103U/L，一天两次。对照组在第27日开始每天皮下注射等体积生理盐水，注射9d后观察。结果显示模型组大鼠卵巢皮质内的各发育期黄体及卵泡少见，卵巢表面呈现苍白状态；可见呈囊性扩张的卵泡，其内部的放射冠或卵母细胞消失；卵泡膜细胞和间质细胞增生；颗粒细胞层数减少为2～3层，且排列疏松。由电镜可见卵泡膜内E2变化不明显而大量睾酮、血清孕酮、脂滴等却明显增高。模型组大鼠血清空腹血糖(FBG)值、空腹胰岛素(FINS)值、HOMA指数均明显高于对照组(P<0.05，有统计学意义)。究其方法机制为用避孕硅胶棒可抑制下丘脑-垂体-卵巢轴，使性激素分泌速率变低，导致不排卵。而HCG在各方面都比LH(促黄体生成素)更强，进而使原来的正常内源性促黄体生成素脉冲式分泌模式遭到破坏，最终使SD大鼠的血清睾酮明显增加。因目前尚无LH制品，HCG的生物作用和化学结构与LH类似，故联合使用HCG来造PCOS动物模型。对于优点可以总结为：皮下埋植剂缓慢、恒定的释放，实验周期短、重复性好且操作简单。该方法在于虽未使LH水平显著升高，却使大鼠模型同时具备了胰岛素抵抗、雄激素水平升高和LH/FSH升高这三大PCOS典型生理病理改变，这是极其关键的。而缺点就在于可能影响促排卵药物的治疗效果，不适合促排卵药物的药效研究。

三、胰岛素(INS)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)造模法

本方法由Poresky[8]创建，他在前人[9]基础上发现高胰岛素的环境可促使LH样作用下的囊性卵泡和卵巢体积增长，于是选择85日龄SD雌性大鼠进行实验，随机分组，其中一组每天2次在皮下注射1.5IUHCG；还有一组皮下注射胰岛素，于第1～10日从0.5U/d逐渐加量到6.0U/d，并按此剂量维持；另一组同时注射HCG和INS，共注射22d。在第23天断头处死，观察各项常见的PCOS病理生理水平发现单用HCG会发生卵巢的单侧或双侧多囊样改变，有小囊泡生成。单纯使用胰岛素者虽胰岛素水平有些许升高但并未发生PCOS样改变，而胰岛素加HCG则出现了PCOS样卵巢和无排卵。INS联合HCG和单用HCG多囊样改变的发生率分别为80%、60%[10]。该模型的组织学符合人体PCOS改变，并通过HE电镜观察阴道涂片从而证实了无排卵；内分泌变化方面则出现了由胰岛素引起的持续存在的高胰岛素血症和外源性HCG造成的大鼠体内长期存在的LH样作用，并由此诱导出高雄激素血症。其原理在于HCG能抑制卵泡颗粒细胞有丝分裂使颗粒细胞数量变少，而胰岛素能刺激卵巢卵泡膜细胞和间质细胞合成雄激素，降低血中SHBG(性激素结合蛋白)含量，从而使雄激素的浓度升高，两者共同作用下，便出现了高雄激素血症及卵泡闭锁，形成多囊症状。该方法总体来讲具有卵巢多囊性改变，无排卵，体质量升高，血清LH和胰岛素显著增加等PCOS样特征，是目前国内比较前沿的研究模型，但不足之处在于有排卵存在，见黄体组织较多、囊泡直径较大，这与PCOS患者的临床症状有些许差异，还不能用于胰岛素抵抗方面的研究。

四、芳香化酶抑制剂法

在本造模法中芳香化酶抑制剂主要指的是来曲唑(Letrozole)，它是由Kafali等[11]首次采用非类固醇的芳香化酶抑制剂建立的一种PCOS动物模型。它能用来建模主要是由于芳香化酶是将雄激素转化为雌激素最后一步的限速酶，它可以将睾酮和雄烯二酮转变成E2和雌酮。来曲唑作为一种芳香化酶抑制剂能够抑制雄激素向雌激素的转换，可导致卵巢生成类固醇激素功能紊乱，产生过多的雄激素，进而引发PCOS症状的无排卵和卵泡闭锁现象。

袁琪等[12]将清洁级6周龄雌性SD大鼠随机分为两组，对照组用1%羧甲基纤维素灌胃，模型组则灌服溶于1%羧甲基纤维素的来曲唑，给药剂量为1mg/kg/d，两组连续灌服21天。于干预期完之后处死大鼠，经过处理和检测后发现模型组所有大鼠失去稳定动情周期且均处于间期，其双侧卵巢重量、体质量均增加，卵巢多囊样发生改变，白膜增厚，与之对应的是黄体数目明显减少。除此之外，模型组在血清FINS、T、LH等方面水平均显著高于对照组(P<0.05)，P水平明显低于正常对照1组，FSH相比之则无统计学意义(P>0.05)。综合来讲，该种模型在内分泌改变还有局部性腺的解剖、组织学改变方面都有独特的优势，尤其是在卵巢形态学改变方面有着无可比拟的优势，是研究多囊卵巢综合征胰岛素抵抗和发病机制令人信服的模型方法之一。而缺点恰恰就在于造模费用高昂，E2水平明显降低，因此不适合研究雌激素水平较高的PCOS。

五、雌激素造模法

该方法多为戊酸雌二醇(EV)造模法。其理论基础为高雌激素刺激会导致下丘脑神经元退化，垂体出现代偿性增生，使垂体对GnRH刺激的敏感性增加，静脉推注GnRH也会致使LH升高，而且雌激素的持续刺激更是对垂体FSH有强烈的抑制作用，从而出现PCOS垂体内分泌环境的典型特征。

邵华等[13]采用的是将雌性SD大鼠随机分为空白组、对照组、低剂量组及高剂量组。空白组不做任何处理；对照组给予一次性肌内注射0.2ml植物油；低剂量组一次性肌内注射含EV2mg的0.2ml油剂；高剂量组一次性肌内注射含EV4mg的0.2ml油剂。于造模后15d、30d、60d各阶段每组各处死3只大鼠，取卵巢，HE染色进行观察。结果显示高、低剂量模型组均出现动情周期紊乱，其30d后的卵巢表面颜色苍白，体积变小，卵泡呈现多囊状扩张。高剂量组比低剂量组的囊状卵泡体积更大，数量更多，颗粒细胞排列也更不规范。但值得注意的是，血清中睾酮和雄烯二酮水平却无明显差异。通过本实验过程和结果分析可知2mg和4mg都可使大鼠动情周期紊乱且卵巢表现出多囊样改变，而且随着油剂在体内缓慢吸收，作用时间延长，卵巢多囊样改变愈加充分。EV诱导的多囊卵巢大鼠模型在垂体、卵巢、下丘脑的神经生长因子(NGF)表达增多也进一步论证了Elisabet Stener-Victorin等[14]关于交感神经兴奋性增加在多囊卵巢形成过程中发挥着重要作用的理论。综上所述，因本方法的卵巢形态学改变及激素分泌水平与人PCOS相似，虽未见有关于脂、糖代谢失调的研究进展，但可作为以生殖内分泌失调为主的PCOS动物模型。

六、结语

以上为现阶段国内外采用比较多的PCOS动物模型建立方法，由于多囊卵巢综合征是一种临床表现多态性的疾病，其发病机制的多因性，临床表现的异质性和复杂性都限制了上述各种造模方法都只能以单方面的特性或者某些方面特性来剖析和构建PCOS模型。由于PCOS是一种高度异质性的疾病，要找到一个能完全模拟人PCOS临床特点的动物模型也是不太现实的，所以还是应该根据研究目的来选择合适的模型。另外，研究者们也仍在努力探索和尝试新的诱导方法，希望能建立更为理想的PCOS动物模型。近年来，人们在内分泌学、形态学等方面的研究力度进一步加深，尤其是对于细胞更深层次的探索，如细胞水平、基因水平等[15]，但尚处于初步探究阶段。相信随着实验动物学的不断发展，未来将会建成更为理想、更公认、更符合发病机制的多囊卵巢综合征大鼠动物模型，从而推动PCOS研究及治疗方法的进步。