赶黄草3种提取物对小鼠内毒素性肝损伤的保护作用

范 玲， 谢星星， 陈 立， 王璐璐， 黄力强， 赵飘飘， 熊玉霞∗

（1.西南医科大学附属医院药物临床试验机构，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属医院药学部，四川泸州 646000；3.西南医科大学附属中医医院药剂科，四川泸州 646000；4.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000）

内毒素是G-杆菌生长时释放或死亡时裂解出来的细胞壁成分，被公认是导致脓毒症、严重休克、多脏器功能衰竭的主要致病因子[1］。肝脏既是清除内毒素的主要场所，也是内毒素血症受损最早、最明显的靶器官之一[2］，肝损伤后对该因子的清除功能减退，轻者出现乏力、精神不佳、食欲不振等亚健康症状，严重者大量内毒素在肝脏未经解毒就溢入人体循环，引起内毒素血症，进而导致呼吸、神经、循环、神经系统等损害，甚至致死性感染性休克、多器官功能衰竭[3-4］。目前，内毒素性肝损伤的治疗措施机制比较单一，大多忽略胆红素升高造成的继发性肝损伤，而且未涉及自身免疫调控，综合治疗力度明显不足，但采取多种药物联合使用必然会增加肝脏负荷，增加患者经济负担，故开发廉价、毒副作用小、增强机体自身免疫调控、药效良好的天然药物成为治疗内毒素性肝损伤的重要任务。

赶黄草学名扯根菜，为虎耳草科扯根菜属植物[5］，主要分布于我国四川、云南、贵州等地，人工栽培品以四川省泸州古蔺为道地产区，民间历来作为药食两用植物[6］，其最主要药理作用为保肝，对各种原因引起的肝损伤具有保护作用[7］，以赶黄草为原料制备的肝苏颗粒在临床上已得到广泛应用，但目前尚无将其用于治疗内毒素性肝损伤的报道。因此，本实验探讨赶黄草在体外对内毒素诱导RAW264.7细胞活化和体内内毒素致小鼠肝损伤的影响，为该植物应用于临床相关疾病的治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 试药 赶黄草 （产地四川，批号150204-1）购自泸州百草堂中药饮片公司，经西南医科大学中药教研室孙琴教授鉴定为虎耳草科扯根菜属植物赶黄草Penthorum chinense Pursh的全草。肝苏颗粒购自西南医科大学附属医院。脂多糖购自美国Sigma公司；肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒购自北京安迪华泰生物科技有限公司；兔抗大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、山羊抗大鼠凋亡相关斑点样蛋白（ASC）购自北京Santa公司；TRITC标记兔抗山羊二抗、FITC标记羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；丙氨酸氨基转移酶 （ALT）、门冬氨酸氨基转移酶 （AST）、超氧物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.2 仪器 多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司；高速低温离心机购自美国Thermo Fisher公司；CO2培养箱购自日本Sanyo公司；倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；EVOS FL无目镜荧光倒置显微镜购自美国AMG公司。

1.3 细胞 小鼠巨噬细胞系RAW264.7由中国科学院上海细胞库提供，在5%CO2、37℃条件下用含10%Gibco胎牛血清的DMEM高糖培养液传代培养，取生长对数期细胞用于实验。

1.4 动物 昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，由西南医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（川）2013-065。小鼠在恒温、光照周期12 h／12 h环境中饲养1周后建立内毒素性肝损伤模型，实验前24 h禁食不禁水。

2 方法

2.1 提取物制备 精密称取粉碎赶黄草3份，分别用水、70%乙醇、95%乙醇按料液比1∶10在85℃下水浴回流提取3次，分别合并3次提取液过滤后蒸发掉大部分溶剂，收集提取液，浓缩后40℃烘干至恒定质量，即得3种对应提取物。

2.2 体外实验

2.2.1 药液配制 提取物用DMSO溶解后经0.22 μm无菌滤膜过滤，-20℃下保存。实验前，用培养基稀释至所需浓度，DMSO终浓度小于0.1%。

2.2.2 安全浓度测定 采用MTS法。取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为2×105／mL后接种于96孔板中，每孔100 μL，37℃、5%CO2培养箱中24 h，吸除旧培养液，分别加入含3种提取物的培养基 （400、 200、 100、 50、 25、 12.5、6.25 mg／L），空白组加含 DMSO 0.1%的培养基，每组设3个复孔，继续培养24 h后加入10 μL MTS溶液，培养2 h后在495 nm波长处检测各孔吸光度，实验至少重复3次。

2.2.3 细胞分组 根据安全浓度测试结果，取对数期生长细胞随机分为空白组、模型组（0.5 mg／L总多糖），及提取物高、中、低剂量组 （分别用含0.5 mg／L LPS的 DMEM 培养液配制成 50、25、12.5 mg／L）。

2.2.4 形态学观察 调整细胞密度为1×106／mL后接种于24孔板，每孔600 μL，37℃、5%CO2培养箱中培养6 h，吸除旧培养基，根据细胞分组处理12 h，每组均设3个复孔，弃去培养基，PBS润洗3次后4%多聚甲醛固定10 min，按照Giemsa试剂盒操作步骤染色，倒置相差光学显微镜下观察细胞形态学的改变。

2.2.5 细胞上清TNF-α、IL-1β水平检测 采用ELISA法。调整细胞密度为2×105／mL后接种于96孔板中，每孔100 μL，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后吸除旧培养液，按 “2.2.3”项下方法分组 （根据前期预实验结果，检测TNF-α、IL-1β时分别处理6、16 h），取培养上清，离心去除细胞沉淀，按照 ELISA试剂盒操作步骤检测 TNF-α、IL-1β水平。

2.3 体内实验

2.3.1 分组、造模及给药 小鼠随机分为空白组、模型组、肝苏颗粒组及提取物组，每组12只，除空白组外各组小鼠尾静脉注射脂多糖 （4 mg／kg）以建立内毒素致肝损伤模型，肝苏颗粒组和提取物组在造模前 12 h、造模后 2 h分别灌胃药液（1 mg／mL）。

2.3.2 肝脏组织学检查 脂多糖注射后12 h，小鼠腹主动脉取血1.5 mL，迅速切取新鲜肝左叶组织2小块，置于10%中性福尔马林磷酸盐缓冲液中固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏病理组织学改变。

2.3.3 血浆AST、ALT水平检测 小鼠腹主动脉取血1.5 mL后，4℃、4 000 r／min下离心10 min，吸取上层血清，立即放入EP管中，-80℃下保存备用。然后，按照相应试剂盒操作步骤检测ALT、AST水平。

2.3.4 肝组织SOD、MDA水平检测 取小鼠肝脏同一部位组织，准确称量约0.5 g，制备肝匀浆液。然后，按照相应试剂盒操作步骤检测SOD、MDA水平。

2.3.5 肝组织ASC、NLRP3表达检测 采用免疫荧光法。取小鼠肝组织切片，65℃下烘片2 h，二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，3%H2O2除去内源性酶。将切片置于枸橼酸溶液中高温修复，自然冷却至室温，滴加0.3%TritonX-100打孔，5%BSA封闭，滴加一抗，4℃下过夜，次日复温，滴加荧光二抗，37℃下避光孵育，甘油封片，激光共聚焦显微镜观察比较并拍照。

3 结果

3.1 细胞活力 根据 《美国药典》中细胞相对增值率与细胞毒性分级的关系，当水提取物、70%乙醇提取物、95%乙醇提取物质量浓度分别在6.25～400、 6.25～100、 6.25～25 mg／L 范围内时细胞毒性分级≤1级，可相应在此质量浓度及以下进行后续药效学实验。见图1。

图1 提取物对细胞活力的影响Fig.1 Effects of extracts on cell viability

3.2 细胞形态 未经脂多糖刺激的细胞呈圆形，抱团生长，突起较少，边界清楚；脂多糖刺激后细胞出现抱团现象明显减少，伪足增加、胞体膨大、细胞边缘不清、形态不规则等活化现象；与模型组比较，70%乙醇提取物组 （25、50 mg／L）细胞伪足明显减少，胞体体积减小，细胞边缘较清楚，形态大体呈圆形，但仍未达到脂多糖刺激前状态。见图2。3.3 细胞上清TNF-α、IL-1β水平 与空白组比较，模型组 TNF-α、IL-1β水平显著升高 （P＜0.01）；与模型组比较，水提取物组、70%乙醇提取物两者水平降低，以后者更显著 （P＜0.05，P＜0.01）。 见图 3。

图2 提取物对细胞形态的影响 （Giemsa，×400）Fig.2 Effects of extracts on cell morphology （Giemsa， ×400）

图3 提取物对TNF-α （a）、IL-1β （b） 水平的影响Fig.3 Effects of extracts on TNF-α （a） and IL-1β （b） levels

3.4 小鼠肝组织病理学变化 空白组小鼠肝组织结构清晰，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状整齐排列，未见变性和坏死；模型组小鼠肝小叶汇管区内大量炎细胞浸润，中性粒细胞增多，肝细胞点状坏死及小灶性坏死，有的呈气球样变化，肝细胞间质见大量充血；与模型组比较，肝苏颗粒组和70%乙醇提取物组炎细胞浸润和中性粒细胞数量明显减少，肝细胞轻度浊肿，未见肝细胞点状坏死。见图4。

图4 小鼠肝组织病理学变化Fig.4 Pathological changes of mouse liver tissue

3.5 血浆AST、ALT水平 与空白组比较，模型组ALT、AST水平显著升高 （P＜0.01）；与模型组比较，70%乙醇提取物组两者水平显著降低 （P＜0.05）。 见表 1。

表1 提取物对ALT、AST水平的影响 （）Tab.1 Effects of extracts on ALT and AST levels（

表1 提取物对ALT、AST水平的影响 （）Tab.1 Effects of extracts on ALT and AST levels（

注：空白组、95%乙醇提取物组各有2只小鼠死亡，模型组、水提取物组、70%乙醇提取物组各有1只小鼠死亡。与空白组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别 脂多糖／（mg·kg-1） 动物数／只 AST／（U·L-1） ALT／（U·L-1）空白组 — 10 62.76±6.94 36.15±6.41模型组 4 11 214.10±26.84∗∗ 221.09±29.30∗∗肝苏颗粒组 4 12 100.24±21.45∗# 99.87±30.54∗#水提取物组 4 11 193.82±14.05∗∗ 98.65±21.58∗∗#70%乙醇提取物组 4 11 144.37±14.01∗# 74.46±12.17#95%乙醇提取物组 4 10 217.97±7.81∗∗ 145.98±24.2∗∗

3.6 肝组织SOD、MDA水平 与空白组比较，模型组MDA水平显著上升 （P＜0.05）；与模型组比较，70%乙醇提取物组MDA水平显著降低 （P＜0.05），同时各组 SOD水平均无显著变化 （P＞0.05）。 见表 2。

3.7 肝组织ASC、NLRP3表达 空白组小鼠肝脏中ASC、NLRP3几乎无阳性表达；模型组小鼠肝脏中两者表达明显增强，而且具有共定位性；肝苏颗粒组和70%乙醇提取物组能明显降低两者表达。见图5。

表2 提取物对SOD、MDA水平的影响 （）Tab.2 Effects of extracts on SOD and MDA levels（

表2 提取物对SOD、MDA水平的影响 （）Tab.2 Effects of extracts on SOD and MDA levels（

注：空白组、水提取物组各有2只小鼠死亡，模型组、70%乙醇提取物组各有1只小鼠死亡。与空白组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

组别 脂多糖／（mg·kg-1） 动物数／只 SOD／[U·（mg prot）-1］ MDA／[nmol·（mg prot）-1］空白组 — 10 135.37±12.09 3.16±0.69模型组 4 11 119.49±19.93 5.48±1.37∗肝苏颗粒组 4 12 132.60±13.5 3.79±0.87#水提取物组 4 10 147.57±20.64 4.85±1.26∗∗70%乙醇提取物组 4 11 137.77±23.6 3.99±0.95#95% 乙醇提取物组 4 12 133.34±22.34 5.48±0.53∗∗

图5 各组ASC、NLRP3表达Fig.5 ASC and NLRP3 expressions in various groups

4 讨论

赶黄草在苗族民间用于治疗肝病，据 《中药大辞典》[8］和 《四川中药志》[9］记载， 其具有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、退黄、平肝的功效。本实验发现，赶黄草70%乙醇提取物可明显降低脂多糖致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平，改善肝脏组织病理变化，提示它可减轻肝细胞损伤，改善肝脏功能。

内毒素性肝损伤的原理是单核细胞或巨噬细胞在外界刺激作用下向肝脏积聚并致敏，致敏的巨噬细胞接触到脂多糖后会释放一些炎性介质 （如自由基、IL-1β和TNF-α等），继而诱发炎症反应，并造成肝细胞损伤[10］。在内毒素性肝损伤中，TNF-α是最关键的细胞因子之一，可与肝星形细胞紧密结合，释放多种炎性介质，形成瀑布效应，也可吸引中性粒细胞进入肝内，并产生蛋白酶及超氧阴离子，多种炎性介质共同构成炎性介质网络，促进炎症反应的级联反应，引起肝脏坏死性损伤[11-12］。IL-1β细胞活性依赖于释放细胞因子水平，当其水平较低时，主要生物学效应是引起组织局部炎症反应，同时也可特异性作用于血管内皮细胞和单核巨噬细胞，进一步促进IL-6合成[13］；但当IL-1β大量产生时，它可进入血流并引发机体发热效应。本实验发现，赶黄草70%乙醇提取物可显著降低 RAW264.7细胞上清 TNF-α、IL-1β水平，可能是赶黄草保护内毒素性肝损伤的重要因素之一。

当机体发生内毒素血症时，脂多糖诱导固有免疫细胞激活，也是加重肝细胞损伤的重要因素[14］。NLRP3炎性复合体是固有免疫的重要组成部分，主要存在于细胞内，是目前研究最广泛的NLR家族成员[15］，其小体活化的共同上游机制包括细胞内K+外流、溶酶体破裂、活性氧 （ROS） 产生[16］。脂质损伤的发生常伴随着 ROS生成，而MDA是反应膜脂过氧化损伤的重要指标之一[11］，故脂多糖致肝损伤中膜脂过氧化损伤引起ROS释放增加是激活NLRP3的主要途径之一。NLRP3是一种复合体支架，当内外源性刺激因素作用于其受体时，它将进行低聚化，进而招募pro-caspase-1和ASC形成NLRP3炎性小体，后者进一步激活Caspase-1，活化后的Caspase-1对前体IL-1β进行剪切，促进后者成熟和分泌[17］，故对NLRP3炎性小体的调控也是治疗LPS性肝损伤的一个重要手段。

本实验发现，模型组肝组织MDA水平明显增加，表明肝细胞膜脂过氧化损伤严重，病理切片显示大量炎性细胞浸润，肝细胞坏死；赶黄草70%乙醇提取物可显著改善上述现象，同时免疫荧光显示它可明显降低脂多糖致肝组织ASC、NLRP3表达。因此，赶黄草70%乙醇提取物对小鼠内毒素性肝损伤的保护作用可能与减少TNF-α产生、调控ROS／NLRP3／IL-1β通路有关，具体机制还有待进一步确认。