基于光学手段建立一种快速检测驴皮的方法

史兆松， 刘 丽， 张 淹∗， 周祥山， 李士栋， 李广华， 孔令梅

（1.东阿阿胶股份有限公司国家胶类中药工程技术研究中心，山东聊城 252201；2.聊城市药品检验所，山东 聊城 252201）

驴皮为马科马属动物驴的皮，是制造传统胶类中药阿胶的唯一原料，所制的阿胶产品具有补血滋阴、润燥止血等功效[1］，为临床常用补益类中药。近年来随着以中医药膏方为核心的滋补类市场的形成和昌盛，以阿胶为代表的补益类中药的需求量逐年增加，逐渐呈现出供不应求之势[2-3］。而市场调查结果显示，在我国毛驴养殖业发展比较滞后，驴的存栏量逐年下降与需求量急剧上升的矛盾日益凸显[4］，连锁式的影响阿胶原料驴皮逐渐紧缺和价格急剧攀升，导致一些不法厂家在利益的驱动下将马皮、牛皮等混入驴皮中作为阿胶的原料[5］。在原料性状鉴别中，由于是驴和马为同科同属动物，马皮与驴皮在毛色、性状和大小等特征方面十分接近，肉眼较难区分。在传统医学中，中医认为马皮具有行血作用，而阿胶为补血类药物，若在阿胶制备过程中掺入马皮，则会起到相反作用，故控制好驴皮的质量对于阿胶及其制品的质量控制相当关键[6］。

目前驴皮药材标准仍未载入 《中国药典》，在2002版《山东省中药材标准》地方标准中，虽将驴皮DNA检验方法纳入驴皮的补充检验方法，但检验操作需要进行DNA提取、PCR扩增和DNA序列测定等，同样文献报道的核磁共振 （NMR）代谢组学技术及其他现代检测方法[7-9］，在样品处理过程中仍需繁琐的操作步骤，因操作方法的复杂性、样品数量的庞大性制约了其产业化应用，因此急需建立一种快速简便、客观稳定鉴别驴皮的方法。

由于不同种的动物毛纤维具有独特的裹面形态特征，在内部微观结构上存在着明显的差别，这种微观结构主要取决于动物的先天遗传差异，具有物种的特异性，并表现出比较复杂的动物生态学特征，动物毛表面鳞片的微观形态结构及其纵断面或横断面特征可作为物种认定和种属鉴定的依据[10-12］。因此，建立一种基于光学手段的驴皮显微鉴别方法，对驴皮及其伪品进行正确判定及净化产业的发展具有十分重要意义。

1 仪器与试药

BK5000型生物显微镜 （重庆奥特光学仪器有限公司）；Y172型哈氏切片器 （上海精密仪器仪表有限公司）；载玻片、盖玻片、单刀片、镊子；火棉胶、甘油、乙醚或石油醚。不同产地 （山东德州、甘肃庆阳、河南沁阳、陕西佳县等）驴皮；牛皮和马皮 （牛皮、马皮购自甘肃张家川供应商），经国家胶类中药工程技术研究中心鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 采样方法

2.1.1 纵压片采样 用镊子从待测动物皮的体侧部位随机采集3～4根试验用动物毛，在石油醚 （30～60℃）中洗去表面的杂质和油脂后，以备观察。

2.1.2 横切片采样 用剪刀从待测动物皮的体侧部位随机采集一定量 （大于500根）的试验用动物毛，将所取毛样的毛尖朝同一方向整理成束，用镊子夹紧在石油醚中清洗干净后，以备观察。

2.2 制片方法[13］

2.2.1 纵压片制片 将采样处理干净后的待测动物毛放在载玻片上，调整位置放平，滴甘油1～2滴，盖上盖玻片压平，以备观察。

2.2.2 横切片制片 将处理干净后的待测动物毛整理成束，平铺在载玻片上排成一列，刷上火棉胶，待火棉胶晾干后将毛束夹入纤维切片器 （Y172型）中夹结实，将两边切去后，还原纤维切片器弹簧装置，并旋转精密螺丝，使毛束露出其金属表面约0.1 mm，在露出的毛束表面再涂上一层火棉胶，待晾干后，用锋利的单刃刀片沿金属面切下，切样时刀片与哈氏切片器间的夹角要小，并保持角度不变，使切片厚薄均匀，将其放在滴有甘油的载玻片上，盖上盖玻片即可。

2.3 显微观察 把待观察切片放到显微镜下，选用不同的视野进行观察，找到最具有代表性的视野范围并进行照相，从照片中挑选清晰的进行对比分析研究。文献报道用普通生物显微镜进行观察，其纵向观察放大到100～200倍即可，横截面需放大到500倍[14］。而本实验对纵向观察和横截面观察均放大到400倍。

2.3.1 表面观察 通过显微镜观察发现，不同产地驴毛表面均比较粗糙，鳞片分布不清晰，鳞片的翘角较大且光泽好，多呈刺状、块片状或芽孢状伸向毛干外侧，分布不均匀；马毛表面比较光滑，鳞片呈波纹状或瓦楞形密布在表面，鳞片的间隙比较大，表面较少有鳞片翘角，多呈沙粒状分布于毛干上，分布不均；牛毛表面比较粗糙，鳞片呈波纹状或瓦楞形层叠密布于表面，鳞片间隙比较小，表面未有鳞片翘角，见图1。

图1 不同动物毛表面显微镜观察

2.3.2 切面观察 通过显微镜对不同动物毛横切面进行显微镜观察，不同产地驴毛横切面均有有明显的髓，且髓质层比较发达，髓质层与皮质层清晰可见，髓腔较大、呈类圆形或长椭圆形；马毛横切面也有明显的髓，且髓质层与皮质层清晰可见，皮质层较厚，髓腔较小、呈似圆形或椭圆形；牛毛横切面无髓，见图2。

通过显微镜对不同动物毛纵切面进行显微镜观察，结果显示不同动物毛纵切面无明显的差异特征，见图3。

2.4 观察结果 通过显微观察法中的表面观察法和横切面观察法，可有效的区分在毛色、性状和大小等方面十分接近的特征。为进一步验证该方法的准确性，采用盲样测定法进行测定，结果可全部准确判断。

3 讨论与结论

图2 不同产地动物毛横切面显微镜观察

图3 不同动物毛纵切面显微镜观察

显微观察法在毛皮种类的鉴别方面多用于毛皮产业服装原料皮的鉴别[15］， 特别在裘皮、貂皮等珍贵皮料鉴别中应用较广泛，同时观察动物毛显微结构方法也较多，如扫描电镜观察首先将毛分别用电胶粘于扫描电镜的样品台上，再用离子溅射仪镀金钯合金后，然后在加速电压扫描电镜下进行观察拍照[16］，这种方法得到的图片清晰，但成本比较高；手摇切片机切片法，须先将待测的毛样进行处理后，再经石蜡包埋后才可进行切取[17］，虽可得到较薄且均匀的切片，但检测周期较长。同样对于驴皮的检验方法，如DNA鉴别、核磁共振代谢组学技术等，在样品处理和测定过程中，需要繁琐的操作步骤和较长的检测周期。

关于阿胶原料驴皮的鉴别，对于夹杂的猪皮、羊皮等，在色泽、形态和张幅上存在很明显的差异，仅靠视角观察即可剔除；对于马皮、牛皮等大张幅皮，由于在毛色、形状和大小等特征方面十分接近，肉眼较难区分。课题组借鉴毛皮产业服装原料皮的检测方法，建立了一种快速、准确、稳定的检测方法，为驴皮检测标准提供了新的思路。