microRNA-122和microRNA-146a联合检测有望用于布病诊断①

梁志娜 陈雅婧 于玖轩 周玉美 郑源强 石艳春

(内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特 010058)

布鲁氏菌病(简称布病)是一种由布氏菌感染所致、全球广泛流行的自然疫源性人畜共患病，为我国法定乙类传染病。近年来，我国布病疫情持续高发，由传统疫区逐步扩散到全国所有区省市，而且有愈演愈烈之势，已经成为重大公共卫生安全问题之一[1]。由于缺乏典型的症状，临床上布病容易被误诊或延迟诊断，导致疾病慢性化，难以治愈。研究表明，核酸检测可用于布病早期诊断，使诊断窗口前移[2]。但临床样本中布氏菌的浓度极低，并且血清抗体与细菌DNA水平之间一致性不高，因而布氏菌核酸检测用于布病诊断及预后评估的前景仍有待研究。

microRNAs(miRNAs)是一类约为22个核苷酸大小的非编码单链RNA，对多种生物功能具有重要的调节作用[3-5]。近年来，miRNAs与疾病发生、发展的关系以及miRNAs作为疾病诊断与预后判断的生物标记等研究取得了许多重要进展[6,7]。然而，miRNAs在感染性疾病尤其是细菌感染所致疾病中的作用还研究较少。前期研究中，我们利用由布病患者和符合要求的健康志愿者血浆样本组成的混合样本和训练样本，采用荧光定量PCR方法分别检测了与固有免疫功能相关的14种microRNA的表达水平。结果发现，布病患者miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a的表达明显受到抑制，但这些miRNAs能否成为布病诊断标记尚需进一步研究[8]。本研究中，我们将利用验证样本对上述5种miRNAs的表达情况及其作为布病诊断标记的可行性进行研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料与主要试剂 2018年3～5月期间在布病门诊收集的确诊布病患者全血和血清样本，并分为两组即经过抗生素治疗组和未经抗生素治疗组。血清样本收集后采用试管凝集试验(SAT)进行抗体滴度检测。全血样本(2 ml)于-20℃保存。健康志愿者与布病患者来自同一地区(性别和年龄均符合要求)，经SAT检测确认为非布病患者。RNA提取试剂盒(南京命码生科科技有限公司)、TaqMan miRNA PCR Kit(ABI公司)、rTaq DNA Polymerase[宝生物工程(大连)有限公司]、人工合成的人miRNAs模拟物(上海吉玛制药技术有限公司)；PCR扩增所需引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.2样本 验证样本由56例未经治疗的布病患者和40例年龄、性别和临床表现均符合要求的健康志愿者组成。同时，为了考察抗生素治疗是否会影响患者血浆miRNAs的表达水平，特别增加了一组32例经过抗生素治疗的布病患者样本。

1.2方法

1.2.1血浆制备及RNA提取 全血样本经1 600 g离心10 min获得血浆上清。利用RNA提取试剂盒从100 μl血浆样本中提取总RNA。100 μl血浆样本与300 μl无RNase水、200 μl苯酚和200 μl氯仿混匀，涡旋混匀后于室温条件下放置15 min。混合物于12 000 g离心10 min后收集位于上层的水相层。加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠溶液和2倍体积的异戊醇。置于-20℃中1 h以沉淀总RNA。16 000 g 离心20 min收集RNA，75%乙醇洗涤1次，室温干燥10 min后重溶于20 μl无RNase水。

1.2.2定量RT-PCR(qRT-PCR) 采用探针法，操作方法按试剂盒说明书进行。为了计算目标miRNAs的表达水平，合成了一系列已知浓度的miRNAs寡核苷酸用水稀释后进行反转录和扩增。目标miRNAs的表达水平参比标准曲线进行计算。

2 结果

2.1miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在验证样本中的表达情况 前期利用混合样品和训练样品得到的实验结果表明，miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在布病患者中的表达水平明显降低，且差异具有统计学意义(P<0.01)。我们进一步利用验证样本评估这5种miRNAs的表达情况，验证样本的资料信息见表1。验证实验结果表明，miR-122、miR-146a和miR-155在未经治疗的布病患者和健康志愿者之间的表达水平差异有统计学意义(P<0.01、P<0.001和P=0.000)，而miR-301a和miR-145a的表达水平在两组人群之间的差异不具有统计学意义(图1)。实验结果还显示，经过抗生素治疗组和未经抗生素治疗组布病患者miR-122、miR-146a和miR-155的表达量均低于健康志愿者(P<0.05)，但两组患者之间这3种miRNAs表达水平的差异不具有统计学意义(P>0.05)。

2.2miRNAs表达水平与抗体滴度的关系 根据标准试管凝集试验(standard SAT)的检测结果，抗体滴度分为1∶50，1∶100和1∶200三个组。通过检测未经抗生素治疗组患者血清miRNAs表达水平与抗体滴度之间的关系，结果发现只有miR-122的表达水平与抗体滴度之间存在显著性关系(图2A)。假设根据抗体水平将样本分为阳性或者阴性样本(分别以1或者0表示)进行分析，则抗体水平与miR-146a和miR-122之间存在显著性关系(图2B)。进一步实验发现，仅有miR-122与其他4种miRNAs的表达水平之间存在显著性差异(图2C)。通过比较miR-122、miR-146a和miR-155在有无明显临床表征的两组患者血浆表达水平发现，这些miRNAs的表达水平与患者是否具有发热、出汗、乏力、关节和腿疼痛等之间无明显相关性(图3)。

表1 验证样本相关信息Tab.1 Demography of validation panel

图1 miRNAs在治疗组或未经治疗组布病患者及健康志愿者之间的表达情况Fig.1 Concentration comparisons of miRNAs between treated/untreated brucellosis patients and healthy volunteers

图2 miRNAs表达水平与抗体滴度之间的关系Fig.2 Correlations between miRNAs expression level and SAT titers

2.3miR122和miR146a作为布病诊断生物标记的准确性评估结果 通过进一步分析以评估miRNAs作为布病诊断生物标记的可行性。根据验证样本(未经抗生素治疗组和健康志愿者组样本)的检测结果，采用AUC(Area under the receiver operating characteristic curve)对诊断的准确性进行评估。5种miRNAs的AUC计算结果见表2。miR-122、miR-146a和miR-155(这3种miRNAs在验证样本实验中均已被证实在布病患者中的表达量显著下降)用于进行诊断的准确性评估试验。结果表明：miR-122、miR-146a和miR-155的AUC值分别为0.851 1、0.795 0和0.863 6。由于miR-122和miR-146a在布病患者和健康志愿者中的表达量差异存在显著统计学意义(P<0.001)(图1)，这两种miRNAs更适于作为诊断标记。miR-122和miR-146a组合的AUC值为0.935，高于两者任何一个单独的AUC值，因此这一组合具有更好的诊断精度(图4)。

图3 miRNAs表达水平与主要临床表征之间的关系Fig.3 miRNAs levels comparison between subjects with/without a specific symptom

表2 microRNA的AUC统计结果Tab.2 Statistics of AUC of different microRNAs

图4 miR-122和miR-146a单独或组合AUC值Fig.4 AUC value for either or combination of miR-122 and miR-146a

3 讨论

由于布病患者通常不具有典型的临床症状，如不能及时确诊和治疗，极易形成慢性、迁延性疾病。当前，布病的早期确诊面临着很大挑战。血清或血浆中miRNAs的表达水平往往与宿主状态存在密切关系并且具有良好的稳定性，已经或有望成为许多疾病诊断和预后判断的生物标记[9-11]。我们的前期研究结果已证实，5种与固有免疫相关的miRNAs(miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a)在布病患者体内的表达水平明显降低。

本研究中，我们利用验证样本进一步评估这5种miRNAs在布病确诊患者和健康志愿者之间表达水平的差异、血清抗体滴度和临床表现的关系，通过计算AUC值考察不同miRNAs单独或组合检测用于布病诊断的可行性。试验中还特别增加了一组经过抗生素治疗的布病患者样本，以便探讨抗生素治疗是否会影响患者血浆miRNAs的表达水平。研究结果表明，miR-122、miR-146a和miR-155在未经治疗的布病患者和健康志愿者之间的表达水平差异具有统计学意义，而在未经治疗和经抗生素治疗的两组布病患者之间差异不具有统计学意义，并且这三种miRNAs的表达水平与患者是否具有临床表现没有明显相关性。miR-146a和miR-122的表达水平与患者血清中是否存在布氏菌抗体之间具有显著性关系。分别计算上述5种miRNAs单独用于布病诊断的AUC值表明，miR-122、miR-146a和miR-155具有更高的AUC值。鉴于miR-122和miR-146a在布病患者和健康志愿者中的表达水平存在显著统计学意义(P<0.001)，我们认为这两种miRNAs更适于作为诊断标记。同时，miR-122和miR-146a组合的AUC值达到0.935，高于两者任何一个单独的AUC值，因此这一组合检测将具有更好的诊断精度。

近年来，miRNAs作为疾病诊断、分级和预后判断等的生物标记研究取得了许多重要进展[12-14]。我们的研究结果提示，与固有免疫相关的miRNAs有望用于布病诊断，尤其是miR-122和miR-146a组合检测具有很高的诊断精度和参考价值。如何进一步提高microRNAs用于布病诊断的便捷性和精确性以及此类标记能否作为布病预后判断尚需进一步研究。