正交试验法优选软肝颗粒水提工艺*

陈剑平 ，胡兆流 ，黄诗莹 ，王佛长 ，郑 平 ，陈秋谷 ，郑 琳 ，易铁钢 ，张尚斌 ，邢宇锋 ，韩志毅 ，童光东 ，周大桥 △

（1.广东省深圳市中医院·深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广东 深圳 518033； 2.广东省深圳市中医院肝病科肝病研究室，广东 深圳 518033）

软肝颗粒是医院治疗慢性肝病的经验方，由醋鳖甲、醋龟甲、麸炒枳壳、丹参、半边莲、黄芪等13味中药组方，具有活血化瘀、软肝散结、益气健脾养阴功效，用于气血瘀滞、气阴两虚所致胁痛、腹胀、口干口苦，尤其适用于肝纤维化、肝硬化的治疗[1－7]。本研究中按医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案的要求，拟将该方进一步研制成颗粒剂。为了全面提取有效活性成分，更好地发挥疗效，根据处方中所含饮片的不同特性，首先对醋鳖甲、醋龟甲饮片的先煎工艺进行考察[8－9]，确定先煎条件，再根据处方中其余各饮片的化学成分和药理等性质[10－13]进行合煎水提工艺考察，以水提液中柚皮苷含量和干膏量为评价指标，采用正交试验对其提取工艺进行优化，为工业化生产提供参考依据。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：LC－20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司，SIL－20A型自动进样器）；CQ－250－DST型超声波清洗仪（功率为250 W，频率为40 kHz，深圳和科达精密清洗设备股份有限公司）；AUMA220D型分析天平（日本岛津公司）；500－2型恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；LD5－2A型低速离心机（北京京立有限公司）。

试药：柚皮苷对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号为WK916051305，纯度不低于98%）；试验所用饮片均购自深圳市康美药业有限公司，经深圳市中医院药检室刘纪青主任鉴定，均符合2015年版《中国药典（一部）》各饮片项下的要求；水为纯化水，甲醇、乙腈（默克公司）为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 饮片先煎工艺考察

粒度：取醋鳖甲、醋龟甲适量，粉碎成最粗粉、粗粉和中粉，备用；称取醋鳖甲、醋龟甲饮片、最粗粉、粗粉和中粉各50 g（醋鳖甲、醋龟甲各25 g），分别加入10倍量水，煎煮1 h，放冷，水提液离心，滤过，定容至 500 mL，量取50 mL水提液，置干燥至恒重的蒸发皿，干燥，称定质量，计算干膏得率。结果饮片、最粗粉、粗粉、中粉的干膏得率分别为 7.66% ，10.18% ，10.33% ，10.23% ，表明饮片的干膏得率较粉碎低，最粗粉、粗粉、中粉的干膏得率差异不大，考虑到可操作性因素，最终采用最粗粉作为醋鳖甲、醋龟甲的先煎粒度。

时间：取醋鳖甲、醋龟甲的混合最粗粉3份，每份50 g（醋鳖甲、醋龟甲各25 g），加入10倍量水，分别煎煮0.5，1.0，1.5 h，放冷，水提液离心，滤过，定容至 500 mL，量取50 mL水提液，置干燥至恒重的蒸发皿，干燥，称定质量，计算干膏得率。结果先煎 0.5，1.0，1.5 h 的干膏得率分别为 10.39% ，10.45% ，10.60% ，表明煎煮时间对醋鳖甲、醋龟甲的干膏得率影响不大，考虑到节约时间因素，最终选择先煎0.5 h作为先煎时间。

加水倍数：取醋鳖甲、醋龟甲的混合最粗粉3份，每份 50 g（醋鳖甲、醋龟甲各 25 g），分别加 8，10，12 倍量水，先煎0.5 h，放冷，水提液离心，滤过，定容至500 mL，量取50 mL滤液，置干燥至恒重的蒸发皿，干燥，称定质量，计算干膏得率。结果加8，10，12倍量水的干膏得率分别为 7.38% ，10.43% ，10.55% ，表明加水倍数对醋鳖甲、醋龟甲的干膏得率影响较大，考虑到节约用水因素，最终选择加10倍量水。

2.2 饮片合煎工艺及干膏含量测定

根据2.1项下考察结果，醋鳖甲、醋龟甲采用最粗粉，先煎0.5 h，后加入其余各味饮片合煎，水提液趁热滤过，放冷，滤液浓缩至200 mL。采用正交试验法，以水提液中柚皮苷含量和干膏量为评价指标，对影响提取工艺的加水倍数（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素 C）进行优选，因素水平表见表 1。量取浓缩液50 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，按照干燥失重测定法（2015年版《中国药典(四部)》通则0831）测定，计算干膏量。

表1 L9(34)因素水平表

2.3 柚皮苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：AgilentTC －C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈(A)－水(B)，梯度洗脱(0～12 min时19%A，12.01～35 min 时 19% → 25%A，35.01～40 min 时19%A)；流速：0.8 mL ／min；检测波长：283 nm；进样量：10 μL。

2.3.2 溶液制备

精密量取 2.2项下浓缩液 1 mL，加甲醇定容至20 mL，过 0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。取柚皮苷对照品0.5 mg，精密称定，加甲醇溶液并定容至1 mL，即得对照品溶液。称取缺枳壳的处方量，按2.2项下方法提取浓缩，按供试品溶液制备方法制作阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性考察：取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进行测定。结果供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处有相同色谱峰，而阴性对照无干扰，详见图1。

图1 高效液相色谱图

标准曲线制备与检出限和定量限测定：精密吸取柚皮苷对照品贮备液适量，加甲醇逐级稀释，分别制得质量浓度为 3.91 ～500.00 μg ／mL（3.91，7.81，15.62，31.25，62.50，125.00，250.00，500.00 μg ／mL）的系列对照品溶液，分别量取溶液10 μL，按拟订色谱条件进样，以柚皮苷峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度(X，μg／mL)为横坐标进行回归分析，得回归方程 Y＝20 157.8 X－51 276.6，r＝0.999 9（n＝8）。结果表明，柚皮苷质量浓度在 3.91 ～ 500.00 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。同时，以峰面积为噪音 3倍（S／N＝3）和10倍（S／N＝10）的进样质量浓度分别测得检出限为0.25 μg ／mL，定量限为 0.74 μg ／mL。

精密度试验：精密吸取2.3.2项下对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果的 RSD为0.15%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取2.3.2项下供试品溶液，按拟订色谱条件分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样分析，记录峰面积。结果的 RSD为 1.04%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取2.2项下提取的同一样品6份，按2.3.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件分析，记录峰面积。结果的 RSD为1.05%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知质量浓度的供试品溶液共9份，分别加入高、中、低3种不同含量的对照品，每组3份，按2.3.2项下方法制备待测溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 柚皮苷加样回收试验结果(n＝9)

2.4 正交试验设计与结果

按 L9（34）正交表设计试验，采用加权评分法分析结果，设定水提液的干膏量和柚皮苷的含量加权系数分别设为0.5，综合评分值＝（干膏量／干膏量最大值＋柚皮苷含量／柚皮苷含量最大值）×0.5×100，结果见表 3和表4。由表3可见，提取条件以A3B3C3为佳。为了验证直观分析结果，对试验数据进行了方差分析，结果表明，因素A和因素C均对水提工艺中干膏量和柚皮苷含量有显著性差异。综合各因素影响水平为煎煮次数C＞A＞B，从溶剂及节省时间考虑，确定最佳提取工艺为 A3B1C3，即加 10 倍量水，煮 3 次，每次煮 1.0 h。

表3 正交试验设计及结果(n＝9)

表4 方差分析结果

2.5 最佳工艺验证试验

为验证所得组合工艺的可行性，进行了3批验证试验。取处方量，按优选工艺进行提取，测定干膏量及柚皮苷含量，结果见表5。可见，验证试验综合评分值的平均值为 96.15，RSD 为 0.59%(n＝3)，表明正交试验优选的条件稳定可行，可作为软肝颗粒的提取工艺。

表5 最佳工艺验证结果

3 讨论

3.1 提取工确定

软肝颗粒方中醋鳖甲具有滋阴潜阳、软坚散结的功效，主要用于肝纤维化的治疗；醋龟甲可滋阴养血、益肾健骨，主要用于增强免疫力和促进康复。醋鳖甲、醋龟甲富含人体必需氨基酸、寡肽、微量元素等不易溶于水的物质，属先煎类药物中甲角类[14－16]，二者活性成分的提取率对肝纤维化的治疗及恢复具有重大影响。为充分提取醋鳖甲、醋龟甲中有效成分，根据中药传统的提取方法，首先采用单因素试验对醋鳖甲、醋龟甲的先煎粒度及先煎时间进行考察，再采用正交试验进行醋鳖甲、醋龟甲药液及其药渣与其余各饮片合煎工艺的考察。对于提取液的纯化，本试验中采用水提浓缩，而非水提醇沉，目的是保持与汤剂一致的化学组成，保证药效；同时，符合《中华人民共和国中医药法》中关于传统工艺配制中药制剂备案工作的要求，以便进一步研制成院内中药制剂。

3.2 评价指标选择

本研究中首选方中丹参中有效成分丹酚酸B作为提取工艺的筛选指标，结果在相同保留时间内存在干扰，分离度低；通过改变流速、调整流动相比例及更换不同流动相进行洗脱，均无显著效果；经研究发现，干扰成分来自半边莲所含有的酚酸类[17]，通过半边莲阴性试验发现相同保留时间内无干扰，可以确定干扰成分来自半边莲，但无法确认半边莲的干扰成分，故排除丹酚酸B作为指标成分。曾对黄芪中的黄芪甲苷进行测定，发现供试品溶液中黄芪甲苷保留时间内同样存在干扰、分离度低的问题，故亦未选取黄芪甲苷作为评价指标。

3.3 不足

经试验发现，枳壳中柚皮苷分离度好，紫外吸收强，出峰无干扰，保留时间相对适中，故最终选取柚皮苷含量作为水提工艺的评价指标[18]。本试验中未能选择处方中君药的有效成分作为评价指标，是本研究存在的不足之处，将在后续研究中进行改进。本方法操作简便，优选出的提取工艺稳定性好、可靠性强，可为进一步将软肝颗粒开发成中药制剂提供重要的试验基础。