重组C因子法检测细菌内毒素的方法适用性研究*

裴宇盛 ，蔡 彤 △，陈 晨 ，高 华 ，魏 霞 ，刘 洋 ，王婷婷 ，祝清芬 ，陆益红 ，朴晋华 ，刘 琦 ，张 蕻 ，李松梅

（1.中国食品药品检定研究院，北京 102629； 2.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101； 3.江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210019； 4.山西省食品药品检验所，山西 太原 030001）

重组C因子法是细菌内毒素检查法的补充替代方法，原理是将鲎试剂中的C因子采用生物技术重组获得，用来替代海洋生物鲎作为鲎试剂原料唯一来源。该方法的推广使用，可保护生态环境、减缓鲎资源枯竭速度[1]。由于鲎资源仅分布于中国及东南亚一带和美国西海岸，我国鲎资源近年逐渐衰减[2]，以厦门为例，20世纪90年代与20世纪50年代相比，鲎资源减少了80% ～90%，现在主要栖息于人工建立的保护区[3]。欧洲大陆的动物保护主义理念的深入推广，如3R理论（对使用实验动物的实验应减少、优化、替代），欧洲官方对重组C因子法认可先于世界其他各国，根据欧洲药典会第160次会议决定，启动将重组C因子法单独作为正文方法（目录号为2.6.32）的工作程序。美国食品药物管理局(FDA)在2012年发布的指导原则中，将重组C因子法列为细菌内毒素检查的补充替代方法。我国目前对重组C因子法的法定地位尚未明确，制备研究逐渐增多[4－7]，但有关重组 C 因子应用的研究较少[8－9]。

本研究中重点考察重组C因子法的品种适用性，选取了有代表性的6个典型品种，每个品种3个批次，进行重组C因子法干扰试验，并经过国内3个实验室进行复核验证。以回收率为评价指标，以2015年版《中国药典》为评价标准，并将4个实验室应用该方法过程中产生的问题和解决方法进行总结，给拟采用该方法的实验室提供相关经验，以加快该方法在我国的应用推广。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SynergyHT型多功能酶标仪（加拿大Biotek生物技术公司）；1389 A2型生物安全柜（美国Thermo有限公司）。

1.2 试药

重组C因子试剂盒（Lonza，货号为50－658U，批号为 0000591563；Hyglos GmbH，货号为 609033，批号为17620）。干扰试验样品，注射用重组人干扰素 α－1b（深圳科兴生物工程有限公司，批号为 201504022，201503008；北京三元基因工程有限公司，批号为20141005；品种1）；注射用磺苄西林钠（海口奇力制药股份有限公司，批号为20140902；湖南尔康湘药制药有限公司，批号为140709－4；瑞阳制药有限公司，批号为15022602；品种2）；消癌平注射液（南京圣和药业有限公司，批号分别为 201510151，201510211，201603171，品种3）；冻干人用狂犬病疫苗（vero细胞，辽宁成大生物制品有限公司，批号分别为 201407210，201407212，201407206，品种4）；甘精胰岛素注射液（山东新时代药业有限公司，批号为201509c003；辽宁博鳌生物制药有限公司，批号为20150310；珠海联邦制药股份有限公司，批号为 20155082Z8A005B；品种 5）；赫赛汀（上海罗氏制药有限公司，批号分别为 N3742，N3749，N3753，品种 6）。

2 方法与结果

2.1 试验设计

仪器灵敏度调节：灵敏度调节试验为预试验，将仪器的灵敏度调整到适合范围，充分发挥试剂的检测能力。标准曲线可靠性验证试验是各个国家药典中规定的方法转移试验，用以证明该实验室可以操作重组C因子法。干扰试验是细菌内毒素检查法的方法学验证试验，用以验证样品能否用于重组C因子法检测。

品种选择依据：为了验证重组C因子法的品种适用性，选取了有代表性的6个典型品种，包括抗生素、生化药品、重组技术产品、中药注射液、病毒疫苗和单克隆抗体。中国食品药品检定研究院为实验室1，山东省食品药品检验研究院为实验室2，江苏省食品药品监督检验研究院为实验室3，山西省食品药品检验所为实验室 4。

2.2 仪器灵敏度调节

使用内毒素标准品和检查用水，配制浓度为0.5 EU／mL的标准内毒素溶液，每步稀释混匀时间不少于1 min。设置仪器参数：激发、发射波长为380 nm和440 nm；温度为37℃；2次读数之间间隔1 h；光学位置为底部；灵敏度（增益值）分别设为 35，40，45，50，55，60，65，70，75，80。加样：0.5 EU ／mL 平行 4 孔，每孔 100 μL，加入酶标板，在37℃孵育10 min。配制检测试剂：按顺序将荧光底物、重组C因子缓冲液、重组C因子酶，按5 ∶4 ∶1（Hyglos的试剂按 1 ∶8 ∶1）比例充分、轻柔混合。混合后的检测试剂须立即使用，不能保存。加样：将每孔中加入0.1 mL配制好的检测试剂，震板10 s。按上述仪器参数设置分别于时间零点和1 h点读数。时间零点检测结果记为 RFU（0），在 37℃孵育 1 h后，再次检测结果记为 RFU（1 h）。按公式 logδRFU ＝log[RFU（1 h）－log RFU（0）]计算。结果判断标准：选取 logδRFU 平均值最接近3.5的灵敏度作为试验灵敏度。

仪器灵敏度调节试验结果见表1。结果显示，当增益值为 60 时，logδRFU（Lonza）为 3.61，最接近 3.5，因此使用Lonza试剂时将仪器灵敏度（增益值）设定为60。当增益值为 65 时，logδRFU（Hyglos）为 3.48，最接近3.5，因此使用Hyglos试剂时将仪器灵敏度（增益值）设定为65。

表1 仪器灵敏度（增益值）调整试验结果

2.3 标准曲线可靠性验证

使用内毒素标准品和检查用水，配制浓度为5，0.5，0.05，0.005 EU ／mL 的标准内毒素溶液，每步稀释混匀时间不少于1 min。另准备细菌内毒素检查用水0.2 mL作为阴性对照。仪器参数设置同上。灵敏度根据2.2项下操作确定。配制检测试剂步骤同2.2项下操作。每个浓度的细菌内毒素平行做3孔，阴性对照平行做 2孔。加样步骤同2.2项下操作，完成后按公式logδRFU ＝log[RFU（1 h）－log RFU（0）]计 算 每 孔 的logδRFU，以logδRFU对内毒素浓度的对数值进行线性拟合，按《中国药典》要求，｜r｜＞ 0.980 即判定为标准曲线可靠性验证试验符合规定。结果显示，4个实验室标准曲线可靠性验证试验均符合《中国药典》规定，阴性对照值均低于标准曲线最低点(r＝0.999)，表明4个实验室均能重复重组C因子法，符合方法确认规定。

2.4 干扰试验

每个实验室均按2.3项下方法制备标准曲线。具体品种名称、稀释处理方法、限度等见表2。供试品阳性对照（回收试验）中，添加的标准内毒素浓度为0.5 EU／mL。每个品种3批，采用2个厂家的重组C因子试剂，每个试验平行2管，进行干扰试验研究，线性范围为（0.005～5 EU ／mL）。

表2 6个品种的试验信息

干扰试验（回收率）结果见表3，结果显示，2个厂家生产的重组C因子试剂，每个品种3批，6个典型品种共计18批次，4个国内实验室的所有回收率均在50% ～200%范围内，符合《中国药典》规定。表明以上6个品种按表2中的处理方法均可使用重组C因子法进行检测，且重复性较好，表明该6个品种在我国能使用重组C因子法进行日常质量控制。干扰试验（内毒素检测值）结果见表4。4个实验室检测结果一致。

表3 18批次样品干扰试验结果（%）

2.5 常见问题与解决策略

4个实验室应用重组C因子法过程中产生的问题和解决策略见表5。常见问题划分为7类21条目，可供拟开展重组C因子法检测内毒素的实验室参考。

3 讨论

3.1 重组C因子法与细菌内毒素检查法的关系

细菌内毒素检查法根据《中国药典》可分为凝胶法和光度测定法。光度测定法又分为动态浊度法、终点浊度法、动态显色法、终点显色法共4种。重组C因子法如收录在《中国药典》中，按此种分类模式应称为终点荧光法，应算作光度测定法中的1种。其操作模式与其他4种光度测定法也很接近，只是由于荧光法的特点，需要预先试验确定仪器的增益值（灵敏度）。作为鲎试剂的重组替代品，从生产工艺来说，应比自然提取的鲎试剂生物变异更小，有利于方法的标准化。

表4 18批次样品内毒素检测值

3.2 细菌内毒素检查法与重组C因子检查法的误差

内毒素检查法的误差问题是重要特点。内毒素检查法被各个国家药典及国际药典所收载。各个国家药典中内毒素检查法内容趋于一致。而其针对灵敏度复核、凝胶法干扰试验、光度法干扰试验回收率对于结果的误差均规定为50% ～200%即符合规定[10]。因此重组C因子法作为内毒素检查法的补充替代方法，其结果误差的允许范围也遵从此规定，本研究中的干扰试验结果也是参考本标准。随着内毒素检查法和重组C因子法的广泛应用与推广，当产品内毒素含量处于质量标准边缘时，更易出现超标结果[11]。因此，药品生产企业在进行质量控制时，要尽量降低产品中的内毒素水平，以免造成检测结果争议[12－13]。

3.3 各种方法的干扰试验

由于细菌内毒素检查法中收载的6种方法，根据欧洲药典收载细菌内毒素检查法应用指导原则，显色法由于与凝胶法和浊度法反应机理不同[14－15]，因此不能将凝胶法和浊度法的干扰试验结论直接外推至显色法。由此推断重组C因子法因采用了荧光反应，同样不能将干扰试验的结论外推到其他方法，必须进行干扰试验验证[16]。本研究中选择的6个典型品种具有一定代表性，可见重组C因子法在品种应用方面具有一定通用性。本研究中也为《中国药典》收载重组C因子法提供了品种应用方面的数据支持。

表5 重组C因子法应用常见问题与解决策略汇总