葡萄疏果多酚类含量及体外抗氧化活性研究

范祺，杨立风，张明，王崇队，张博华，马超

（中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）

我国是葡萄的生产和出口大国，2017年中国的葡萄种植面积约80万hm2，总产量比上年增加了40万t，达到了1120万t[1]。葡萄座果率高，需要进行疏果，随着我国葡萄产业的迅速发展，每年因疏果产生大量的废弃物，这些废弃物直接弃置，不仅造成了资源浪费，还污染了环境。

葡萄含有一系列对人体健康有利的成分，葡葡多酚是其中重要的活性成分。葡萄多酚是一种植物多酚类活性物质，是葡萄次生代谢产物中的重要组成部分，葡萄中较重要的多酚类物质为黄酮型多酚类，包括多酚、儿茶素、黄酮、黄酮醇、黄烷醇、黄酮单宁、查耳酮以及花色苷等[2]。作为一种天然抗氧化剂，葡萄多酚已广泛应用于医疗保健、食品加工等领域，开发利用葡萄多酚具有重要的现实意义[3]。随着农业循环经济和葡萄酒产业可持续发展观点的提出，近年来从葡萄园农业废弃物和葡萄工业废弃物中提取葡萄多酚成为研究重点，葡萄多酚具有很强的抗氧化作用[4]，且其抗氧化活性因葡萄的成熟度、品种、所在部位和生长环境等因素的不同而有所区别。目前葡萄多酚可以利用葡萄叶、根、枝条等部位进行工业化生产，但是对于葡萄疏果的开发利用研究基本为零。因此针对疏果天然活性成分的开发利用，对于实现废弃物的再利用和环境保护都有积极的意义[5]。本研究以13个不同品种的葡萄疏果为研究对象，分析了疏果中多酚和黄酮含量，并对其抗氧化活性进行测定分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

13个品种的葡萄来自于济南章丘附近的葡萄园，分别为温可、A17、夏黑、腾稔、红巴拉多、维多利亚、红宝石、火焰无核、摩尔多瓦、金手指、玫瑰香、阳光玫瑰、巨峰。样品采集于8月上旬，随机选取成熟度相似且大小一致的疏果，每个品种采集1～2 kg。

Folin-Ciocalteu试剂、碳酸钠、芦丁、DPPH、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、水杨酸、三氯化铁、硫酸亚铁、双氧水、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸盐、甲醇、乙醇等，均为分析纯级别。

1.2 仪器与设备

ME104电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；SHA-B双功能水浴恒温振荡器，江苏杰瑞尔电器有限公司；UV1000紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；RE-501旋转蒸发仪，上海越众仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

准确称取不同品种的葡萄疏果2～3 g，精确到小数点后四位，置于 50 mL 提取管中，按 1：10（M：V）加入 50%无水乙醇，经剪切机剪切破碎3 min，在70℃条件下水浴提取1 h后经抽滤收集滤液，滤液转入50 mL容量瓶中，定容至刻度，待测。

1.3.2 总多酚含量的测定

（1）标准液的配制

准确称取没食子酸0.0250 g，用蒸馏水溶解并定容到1000 mL，得到浓度为0.025 mg/mL的标准储备液[6]。

（2）标准曲线的建立

准确吸取 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL的没食子酸标准储备液置于25 mL的棕色容量瓶中，分别加入福林酚试剂1.0 mL，混匀，5 min后加入1 mL、10%的Na2CO3溶液，充分混合后定容，30℃避光放置30 min，以不加标准液的溶液为空白对照，在760 nm波长下测定吸光值，每个样品平行测定3次。以没食子酸在反应体系中的质量浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

（3）总多酚含量的测定

多酚的含量测定参照贾荣等[7]的方法。将0.1 mL提取液加入到1 mL蒸馏水的试管中，振荡后加入1 mL福林酚试剂，混匀，5 min后加入1 mL、10%的Na2CO3溶液，充分混匀，在30℃黑暗处反应30 min，在760 nm波长处测定吸光度。

1.3.3 总黄酮含量的测定

（1）总黄酮含量测定

将0.5 mL提取液加入试管，并用60%的乙醇溶液补充至2.5 mL，加入5%的NaNO2溶液0.15 mL，摇匀，室温放置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.15 mL，摇匀，室温放置6 min，加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，室温放置20 min，于510 nm处测定吸光值。

（2）芦丁标准曲线绘制

参考夏光辉等[8]采用硝酸铝显色法绘制芦丁标准曲线。称取芦丁5.1 mg，用乙醇定容至50 mL，准确吸取标准应用液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于容量瓶中，加50%乙醇至5 mL，加 5%NaNO2溶液0.15 mL，摇匀，放置6 min，分别加10%Al(NO3)3溶液0.15 mL，摇匀，放置6 min，加 1 mol/L NaOH 溶液 2 mL，放置 15 min，于 510 nm波长处测定吸光度。

1.3.4 体外抗氧化活性的测定

（1）对DPPH自由基清除能力

各待测样品适当稀释后用移液枪取1 mL，加入1 mL、0.4 mmol/L DPPH的甲醇溶液，混合均匀，加入2 mL水，30℃水浴30 min，在517 nm处测定吸光值。同时以1 mL、DPPH+1 mL甲醇溶液混合后的吸光值为空白组[9]。

（2）对羟自由基清除能力

测定方法参照曾军等[10]的方法，量取1.8 mmol/L的FeSO42 mL放入试管中，加入1.8 mmol/L水杨酸1.5 mL，加入不同浓度样品溶液1 mL，最后加入0.03%H2O20.1 mL并启动整个反应，37℃反应30 min后，2000 r/min离心10 min，以蒸馏水代替样品溶液做空白参比，在510 nm测定吸光值。

（3）还原力测定

参照齐岩等[11]的测定方法，取不同量待测液加去离子水补足至1 mL，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和1%的铁氰化钾溶液各2 mL，混合均匀，50℃保温20 min，放至室温，加入2 mL 10%三氯乙酸，混合均匀，静置10 min。取混合液2 mL，加2 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3，混合均匀，放置10 min，在700 nm下测定吸光度。同时以去离子水代替样品做空白对照。

1.4 数据分析

每个试验重复3次，数据采用Origin 9.0作图，并用SPSS 20.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

图1为没食子酸标准曲线，在760 nm波长处测定吸光度，所得标准曲线方程为y=0.0409x+0.0543相关细数R2=0.9996，线性关系良好，可以此来计算葡萄疏果中的多酚含量。

图2为芦丁标准曲线，线性回归方程为y=6.6982x＋0.0048，相关系数R2=0.9999，线性关系良好，可以由此回归方程计算葡萄疏果中黄酮的含量。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

2.2 多酚含量的比较

图3 不同品种葡萄疏果多酚含量Fig.3 Contents of polyphenols in various kinds of grape prethins

图3为不同品种葡萄疏果多酚含量，由图3可知，13个不同品种葡萄疏果总多酚含量有较大的差异，变化范围为2.87～8.21 mg/g，13种葡萄疏果多酚含量大小的顺序为：摩尔多瓦>A17>温可>红巴拉多>金手指>玫瑰香>藤稔>阳光玫瑰>维多利亚>火焰无核>红宝石>巨峰>夏黑。含量最高的为摩尔多瓦，最低的为夏黑，卢静等[12]测定了葡萄果渣中多酚提取量为3.39 mg/g，姜黎等[5]提取的葡萄皮渣中多酚含量达17.79 mg/g，与其相比葡萄疏果中多酚含量处于中游水平，可以作为葡萄多酚的提取原料。

2.3 黄酮含量的比较

图4为不同品种葡萄疏果黄酮含量，黄酮的含量在6.0～17.9 mg/g范围内变化，含量最多的为摩尔多瓦，最少的为夏黑。13种葡萄疏果多酚含量大小的顺序为：摩尔多瓦>A17>温可>金手指>红巴拉多>维多利亚>藤稔>玫瑰香>火焰无核>阳光玫瑰>巨峰>红宝石>夏黑。

图4 不同品种葡萄疏果黄酮含量Fig.4 Contents of flavones in various kinds of grape prethins

综合图3、4可以看出，多酚含量多的品种其黄酮含量也相对较多，多酚含量最多的品种为摩尔多瓦，其黄酮含量也最高；多酚含量最少的为品种为夏黑，其黄酮含量也最少。

2.4 抗氧化性比较

2.4.1 DPPH自由基清除能力比较

如图5所示，半数清除率IC50反映了被测样品的抗氧化能力，数值越小，样品的抗氧化能力越强。由图可以看出，不同品种葡萄之间DPPH自由基清除能力相差较大，其中清除能力最强的是摩尔多瓦，IC50为28.04 μg/mL；清除能力最差的品种为夏黑，为 375 μg/mL。温可、腾稔、红巴拉多、玫瑰香和阳光玫瑰清除能力相近，红宝石、火焰无核和巨峰三个品种之间的清除能力相近。

图5 不同品种葡萄疏果多酚对DPPH自由基的半数清除率Fig.5 IC50of scavenging DPPH of various kinds of grape prethins polyphenols

2.4.2 羟自由基清除能力

羟自由基清除试验结果见图6，由图可以看出，不同葡萄品种的羟自由基清除能力相差较大，清除能力较强的为摩尔多瓦、A17和玫瑰香，IC50值分别为 248、442、459.8 μg/mL；羟自由基清除能力较弱的为巨峰和火焰无核，IC50值分别为 1881 μg/mL和1500 μg/mL。

图6 不同品种葡萄疏果羟自由基清除能力测定Fig.6 Hydroxy radical scavenging capacities of various kinds of grape prethins polyphenols

2.4.3 还原力比较

图7（见下页）为不同品种葡萄疏果还原力测定，由图7可以看出，13种样品的吸光值随着浓度的不断增大而稳步升高，且具有一定的线性关系。说明13种样品的总还原能力与样品浓度具有剂量关系。斜率越大，还原能力越强，其中还原力最强的是摩尔多瓦和A17两个品种，还原力最弱的为夏黑。

图7 不同品种葡萄疏果还原力测定Fig.7 Reducing capacities of various kinds of grape prethins polyphenols

3 结论

13种葡萄疏果中多酚与黄酮含量相差较大，多酚和黄酮含量最高的品种均为摩尔多瓦，含量分别为8.21 mg/g和17.9 mg/g。含量最少的品种为夏黑，含量分别为2.87 mg/g和6.0 mg/g。摩尔多瓦、A17、温可和玫瑰香品种的多酚、黄酮含量较高，抗氧化活性比较高，可作为葡萄多酚的提取来源；夏黑与红宝石两个品种的多酚、黄酮含量较少，抗氧化活性也比较低。