原位缺口末端标记法观察加味青蒿鳖甲汤干预Lewis肺癌小鼠细胞凋亡的研究

蔺禹帆，粟 栗

（长春中医药大学，长春 130117）

肺癌，即原发性支气管癌，为起源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤[1]。有调查显示，不论是在发达国家还是在发展中国家，肺癌的发病率均为恶性肿瘤发病率之首；并预测到2020年，在发展中国家中，肺癌的发病率仍排名第一位[2]。我国第三次死亡原因调查结果显示，肺癌已成为我国癌症死亡原因的首位，与上世纪70年代比较上升了465%[3]。虽然肺癌的治疗技术日新月异，但5年生存率从4%仅上升至12%左右，现有的抗肿瘤药物仍只能起到缓解病情作用，患者无进展生存期平均仅延长3个月～5个月。因此，对于肺癌的治疗是医学界共同面临的难题。

青蒿鳖甲汤出自清代温病学家吴鞠通所著的《温病条辨》。根据临床肺癌常见辨证分型进行加减化裁，组成加味青蒿鳖甲汤，在临床应用中对于提高机体内在抗病能力来抑制肿瘤的生长、减少放化疗所带来的不良反应、控制癌性发热等方面具有良好的疗效。

本实验采用原位末端标记法，研究加味青蒿鳖甲汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡的影响，通过对凋亡指数的分析，探讨加味青蒿鳖甲汤干预肿瘤细胞凋亡的作用。

1 实验材料

1.1 实验细胞 Lewis 细胞株（Lewis Lung carcinoma，LLC），于中国科学院细胞库购买。

1.2 实验动物 健康C57BL/6小鼠（18 g±2 g）70只，SPF级，6周龄，雄性，于辽宁长生生物技术有限公司购买。符合国家标准固体混合饲料喂养，自由饮食及饮水。实验室内光线充足，温度与湿度适宜。实验开始前适应性喂养一周。

1.3 受试药物 加味青蒿鳖甲汤由青蒿、鳖甲、生地、知母、丹皮、黄芪、地龙、姜半夏、白花蛇舌草共9味中药组成（长春中医药大学附属医院）；顺铂注射液：6 mL：30 mg（江苏豪森药业股份有限公司）。

1.4 试剂 1 640培养基（武汉Boster生物工程有限公司）；胎牛血清（美国gibco公司）；胰蛋白酶（武汉Boster生物工程有限公司）；二甲基亚砜（Biosharp生物科技）；青霉素和链霉素（山东鲁抗）；TUNEL试剂盒（上海生工）；DAB显色试剂盒（迈新试剂）；4%水合氯醛，福尔马林，各个浓度乙醇，二甲苯等。

1.5 仪器 150i CO2恒温细胞培养箱（美国Thermofisher公司）；超净台（美国Thermofisher公司）；DMI3000 倒置显微镜（德国Leica公司）；烘箱（美国Thermofisher公司）；SX-500高压蒸汽灭菌锅（TOMY公司）；石蜡切片机，组织自动包埋机等。其他：培养瓶、培养皿、离心管、血清瓶、微孔过滤膜、石蜡膜、恒温水浴箱、离心机、医用直尖眼科剪、医用弯尖眼科剪、医用止血钳、直头镊子、弯头镊子，医用纱布、医用棉球、灌胃器、注射器、微量移液器、EP管若干等。

2 实验方法

2.1 细胞培养 应用1640培养基、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素+链霉素）配制全培养基，于二氧化碳恒温培养箱中培养Lewis肺癌细胞。用倒置显微镜观察Lewis肺癌细胞，细胞呈圆形或椭圆形并有部分细胞悬浮在培养基中。当细胞贴壁数量达培养瓶底壁的80%左右时，此时细胞生长状态良好，可传代、冻存。整个过程一定要严格遵守无菌操作。

2.2 荷瘤小鼠模型的制备 将细胞浓度调整到约4×107个/mL，用1 mL注射器每次抽取0.05 mL细胞悬液，接种于C57BL/6小鼠右腋后线处皮下。在接种过程中应不断吹打细胞悬液，防止细胞沉降而造成接种细胞浓度不均，并尽量缩短造模时间。造模后，每天检查小鼠接种部位。到造模第8天时，在小鼠接种部位可触及米粒大小肿块，表示造模成功。

2.3 实验分组及给药 选取造模成功 的小鼠，测量每只小鼠肿瘤的长轴（a）与短轴（b），按照v=ab2/2计算出每只小鼠肿瘤的体积。按照肿瘤体积的大小，将小鼠随机分为模型组，加味青蒿鳖甲汤低剂量组、加味青蒿鳖甲汤中剂量组、加味青蒿鳖甲汤高剂量组、顺铂组，每组10只。造模第8天开始，模型组给予生理盐水0.4 mL灌胃，1 d/次；加味青蒿鳖甲汤低、中、高剂量组分别按照1:2:4的比例给予中药汤剂0.4 mL灌胃，1 d/次；顺铂组给予浓度为0.15 mg/mL的顺铂注射液0.2 mL腹腔注射，隔日1次。

2.4 取材 给药第15天取材。取材前称小鼠的体质量，按照0.1 mL/10 g的标准用4%的水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血后，脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤。将肿瘤组织应用福尔马林固定。

2.5 TUNEL法检测 将用福尔马林固定好的肿瘤组织，修整为大小约为0.3 mm×1.0 cm×1.0 cm的组织块，放入脱水盒中，用自来水冲洗去福尔马林固定液。常规脱水、石蜡包埋，连续切片，片厚3 μm。采用TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒（POD），按说明书操作。光学显微镜下观察组织细胞染色情况。

2.6 统计方法 应用SPSS 19.0，采用单因素方差分析分析处理。

3 实验结果

脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法（TUNEL），对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。细胞核呈蓝色者为苏木精复染的阴性细胞，即肿瘤细胞。模型组内仅见个别凋亡细胞；低剂量组有少量的凋亡细胞；中剂量组可见凋亡细胞；高剂量，顺铂组可见大量凋亡细胞。（见图1）

图1 加味青蒿鳖甲汤对Lewis肺癌小鼠细胞凋亡的影响

每张切片选取5个高倍镜（10×40）视野，按照“每张切片至少计数500个细胞，计算每100个细胞内的阳性细胞数，以百分数表示（%）计算细胞凋亡指数。与模型组相比较，各用药组的凋亡指数明显升高（P＜0.01），有统计学意义。顺铂组的凋亡指数高于中药各组，有统计学意义。详见表1。

表1 加味青蒿鳖甲汤对细胞凋亡指数的影响（±s）

表1 加味青蒿鳖甲汤对细胞凋亡指数的影响（±s）

注：与模型组比较，# P＜0.01；与顺铂组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 数量/只 细胞凋亡指数/%模型组 8 7.59±2.04中药低剂量组 9 26.68±2.96#△△中药中剂量组 9 31.38±4.72#△△中药高剂量组 9 38.71±3.81#△顺铂组 7 51.07±5.67#

4 讨论

对于多细胞生物而言，为了维持机体的正常代谢过程和内环境的稳定，会有大量“多余的”或“生病的”细胞以死亡的方式被处理掉，1972年，病理学家Kerr等人将自然细胞死亡过程定义为凋亡[5]34。细胞凋亡是一个程序化的过程，这一程序早已预设于活细胞之中，当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用的时候，这一程序启动，并由严格和复杂的信号网络调控而发生自主性细胞有序死亡过程[5]，34.50%以上的肿瘤细胞在凋亡机制上存在缺陷，凋亡异常直接导致本该死亡的细胞被保留下来，其中有些突变的细胞增殖失控，从而形成肿瘤[6]。

细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学、生物化学、细胞学及分子生物学的改变，其中，最重要和最具特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180～200 bp为最小单位的单体或寡聚体片段[7]177。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法（TUNEL）是分子生物学与形态学相结合的研究方法，于1992年由Gavricli等首先报道[7]188。本实验应用的TUNEL法，采用蛋白酶K消化法对标本细胞打孔，后将标本与末端转移酶（TdT）和过氧化酶标记的脱氧核苷酸（dUTP）一起温育，在温育过程中，TdT将标记的dUTP连接到DNA片段的自由3’-末端上，DAB显色后，在光学显微镜下进行观察[7]179。

在临床应用中，青蒿鳖甲汤加味主要针对癌性发热、放化疗后体虚以及癌转移等症状。目前认为癌性发热主要与肿瘤坏死组织的吸收、肿瘤的某些代谢产物致热原、肿瘤组织释放前列腺素 E、器官代谢失常及肿瘤组织自身存在炎症有关[8]。临床上治疗癌性发热多以物理降温或使用非甾体类消炎镇痛药、糖皮质激素等对症治疗为主，故而中医治疗具有一定的优势。周军等[9]运用青蒿鳖甲汤加减治疗癌性发热54例，其中显效30例、有效16例、无效8例，有效率为85%。司瑞超[10]、董方[11]、任惠芳等[12]临床医生应用青蒿鳖甲汤加减治疗癌性发热，并与吲哚美辛栓、消炎痛栓、痰热清、塞来昔布等临床常用药比较后，认为青蒿鳖甲汤加减治疗癌性发热具有良好的疗效。另外，臧凯[13]、王蓉等[14]、李丽[10]通过临床观察，认为青蒿鳖甲汤加减对于改善放化疗所带来的不良反应，提高生活质量以及抑制转移等方面具有良好效果。本实验结果从形态学上证实，加味青蒿鳖甲汤具有诱导小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的作用，也进一步阐明了，其可以通过促进肿瘤细胞凋亡来达到抑制肿瘤细胞的目的。表明加味青蒿鳖甲汤对于肺癌的疗效，可兼顾临床表现以及肿瘤本身，达到标本兼治的目的。