紫外-可见分光光度法测定止痛祛风胶囊中总黄酮含量

庞学丰 梁国成 方建康 陈舒茵 江丽芬 陈壮 冯玉青 李玉玲 唐丽萍 黄政治 廖家瑜

【摘 要】目的：建立紫外-可见分光光度法测定止痛祛风胶囊中总黄酮含量的方法。方法：采用体积分数为70%的乙醇超声提取总黄酮，以芒果苷为对照品，紫外-可见分光光度法测定止痛祛风胶囊中的总黄酮含量，检测波长380 nm。结果：芒果苷在0.001 15～0.009 2 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率为86.14%，RSD为4.99%。结论：采用紫外-可见分光光度法测定止痛祛风胶囊中总黄酮含量的方法，操作简便，重复性好，可作为止痛祛风胶囊总黄酮的含量测定方法。

【关键词】 止痛祛风胶囊;紫外-可见分光光度法;总黄酮;含量测定

痛风是单钠尿酸盐沉积于骨关节、肾脏和皮下等部位，引发急、慢性炎症和组织损伤，与嘌呤代谢紊乱和（或）尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关[1]，是临床常见疾病之一。本病最常见的表现形式为痛风性关节炎急性发作。目前，西医主要予抗炎镇痛、抑制尿酸生成药或促进尿酸排泄药治疗，虽然有一定疗效，但长期服用会产生很多不良反应，患者难以坚持。目前，尚无根治药物，研究开发新的药物，尤其是疗效肯定且不良反应少的中药尤为必要。

止痛祛风汤是笔者在多年临床实践中总结出来的治疗痛风性关节炎的经验方，由白芍、知母、萆薢、肿节风、忍冬藤、葫芦茶、两面针、葛根、桂枝、土茯苓、甘草等药物组成，具有清热解毒、活血、祛风除湿、通络止痛之功效，临床应用及实验研究表明具有确切的疗效[2-4]。将其制备成胶囊剂，能掩盖药物不良嗅味，提高药物稳定性，且携带方便。方中知母、萆薢、肿节风、忍冬藤、葫芦茶、葛根、土茯苓和甘草等均含总黄酮[5-7]，总黄酮是止痛祛风胶囊的重要药效成分之一。本研究通过提取方中有效成分，并建立含量测定的方法，为能够直观、有效控制产品质量，乃至制定产品质量标准提供有效依据，对整個处方的质量监控，保证制剂的准确性及有效性，具有积极的意义。

1 实验材料

1.1 仪 器 AL204分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;WFH-205B可见透射紫外反射仪（上海精科实业有限公司）;CQ-250 超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）;紫外-可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2 试剂与药品 止痛祛风胶囊（医院自制，生产批号180425，180507，180524）;芒果苷对照品（中国食品药品检定研究院，生产批号111607-201704，含量测定用）;甲醇（成都市科龙化工试剂厂，分析纯）;乙醇（上海沃凯生物技术有限公司，分析纯）;纯化水（自制）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取5.75 mg的芒果苷，以体积分数为70%的乙醇溶解并置于50 mL容量瓶中超声溶解，静置冷却至室温;用体积分数为70%的乙醇定容，即制成每毫升含0.0194 5 mg对照品溶液，备用。

2.2 供试品溶液的制备 取本品止痛祛风胶囊内容物，精密称取50 mg，置于50 mL容量瓶中，以体积分数为70%的乙醇溶解并稀释至刻度线，超声提取1 h，冷却至室温;用体积分数为70%的乙醇补足至刻度，摇匀，过滤，滤去初滤液;取续滤液25 mL，置于50 mL的容量瓶中，加入体积分数为70%的乙醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2.3 检测波长选择 分别取对照品溶液和供试品溶液，以体积分数为70%的乙醇溶液为空白试剂，进行紫外全波长扫描[8-9]。结果显示，芒果苷对照品溶液与供试品溶液光谱图基本一致，且空白试剂无干扰，最终选择检测波长为380 nm。

2.4 线性及线性范围的考察 精密吸取芒果苷对照品溶液1，2，4，6，8 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加体积分数为70%的乙醇稀释到刻度，摇匀，分别取上述溶液，采用紫外-可见分光光度仪进行测定;以吸光度为纵坐标，溶液浓度为横坐标进行回归，绘制标准曲线，得到回归方程为y = 54.255 x + 0.019 4（R = 0.999 4），结果表明，芒果苷在0.001 15～0.009 2 mg·mL-1范围内呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取止痛祛风胶囊供试品溶液，在380 nm波长下连续测定5次，吸光度分别为0.477，0.482，0.463，0.499，0.491，其吸光度RSD = 0.55%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取止痛祛风胶囊供试品溶液，在380 nm波长下，分别于0，1，3，6，9，12 h测定，吸光度分别为0.499，0.483，0.492，0.475，0.463，0.477，其吸光度RSD = 0.44%，表明溶液在12 h内的稳定性良好。

2.7 重现性试验 取同一批次的止痛祛风胶囊5份，

分别按2.2项下平行制备止痛祛风胶囊供试品溶液，并依法进行测定，吸光度分别为0.478，0.482，0.464，0.499，0.491，吸光度RSD = 0.55%，表明样品重现性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的止痛祛风胶囊供试品5份，分别精密加入芒果苷对照品，依2.2项下制备供试品溶液，依法测定其中总黄酮含量，计算加样回收率。结果见表1。

2.9 样品含量测定 取不同3个批次的止痛祛风胶囊，分别按2.2项下平行制备止痛祛风胶囊供试品溶液，并依法测定批号为180425，180507，180524的样品，对应的总黄酮含量分别为0.037，0.036，0.035 mg·mg-1。

3 讨 论

3.1 紫外-可见分光光度法 此法以分子吸收光谱为基础，利用多数化合物的分子在200～800 nm光谱范围具有紫外吸收的特点进行分析和测定，或经显色后产生紫外吸收而测定[10]，具有设备简单、适用性广、准确度和精密度好等优点，已在中药含量测定如总黄酮含量分析中广泛应用，且发挥着越来越重要的作用。

3.2 关于提取溶剂的选择 中药有效成分提取工艺条件的筛选，评价指标的选择十分关键。本次实验对提取工艺进行单因素预筛选，比较甲醇和体积分数为50%、60%、70%的乙醇的提取工艺，采用超声提取1 h，取样处理后测定总黄酮含量，结果体积分数为50%的乙醇和体积分数为60%的乙醇总黄酮提取率相对较差，分别为0.029 mg·mg-1和0.033 mg·mg-1，而甲醇和体积分数为70%的乙醇提取的总黄酮相对较好，且差别不是很大，分别为0.037 mg·mg-1和0.036 mg·mg-1;但考虑到甲醇具有一定的毒性，且止痛祛风胶囊用于口服，故选择体积分数为70%的乙醇作为本品研究的提取溶剂。此外，对回流提取法和超声提取法进行研究比较，结果表明，两者提取总黄酮的含量差异不大，由于回流提取所需时间较久，且操作较为麻烦，最终选定超声提取法，超声提取1 h，处方中的总黄酮含量不再增加，因此选定用体积分数为70%的乙醇超声提取1 h。

3.3 关于紫外测定总黄酮含量测定方法研究 黄酮类化合物作为止痛祛风胶囊的主要活性成分之一，具有降脂、抗血栓、抗氧化、降糖等多種生理活性[11]，是止痛祛风胶囊治疗痛风的主要作用机制。其结构以2-苯基色原酮为母核的衍生物。紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成，出现在300～400 nm的吸收带称为带Ⅰ，是由B环桂皮醛系统的电子跃迁所产生的吸收;出现在240～280 nm的吸收带称为带Ⅱ，由A环苯甲酰基系统的电子跃迁而产生吸收[10]。在研究总黄酮的含量测定方法时，笔者进行了全波长扫描，选用芒果苷为对照品，发现芒果苷对照品与止痛祛风胶囊总黄酮在波长200～500 nm可见紫外吸收光谱图基本呈一致，且在波长380 nm处附近无太大的干扰，所以选定380 nm的条件为紫外检测波长。

4 参考文献

[1] 葛均波，徐永健.内科学[M].北京：人民卫生出版社，2013：856-859.

[2] 庞学丰.自拟止痛祛风汤治疗痛风性关节炎疗效观察[J].广西中医药，2006，29（6）：7-8.

[3] 庞学丰，唐丽萍，冯玉青，等.止痛祛风汤对大鼠急性痛风性关节炎影响的实验研究[J].风湿病与关节炎，2012，1（3）：50-52.

[4] 庞学丰，王思超，蒙宇华，等.止痛祛风汤对急性痛风性关节炎大鼠血清IL-6、IL-8的影响[J].风湿病与关节炎，2017，6（5）：8-10.

[5] 李航，张冲，王莹，等.黄芪总黄酮对小鼠佐剂性关节炎的治疗作用[J].安徽农业科学，2015，43（27）：77-78.

[6] 王红丽，管俊，冯静，等.桑寄生总黄酮对大鼠佐剂关节炎模型的影响[J].世界中医药，2018，13（4）：799-802.

[7] 韦贤，王金妮，李振中，等.五色梅总黄酮治疗Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎及其机制[J].医药导报，2015，34（2）：189-192.

[8] 周林，陈彦琳，杜杰，等.UV测定麸炒枳壳中总黄酮含量[J].中国现代中药，2009，11（10）：20-21.

[9] 董绍雯.UV法测定罗银胶囊中总黄酮的含量[J].江西中医药，2012，43（5）：66-68.

[10] 匡海学.中药化学[M].北京：中国中医药出版社，2004：154-160.

[11] 李国政，肖扬.枳壳黄酮药理学研究进展[J].山西中医，2017，33（11）：59-62.

收稿日期：2018-07-24;修回日期：2018-11-01