5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的质量鉴定及经皮渗透效果

庄远红, 刘静娜, 潘裕添, 庞 杰

(1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000； 2.闽南师范大学菌物产业工程技术中心，福建 漳州 363000；3.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

壳聚糖是由甲壳素脱乙酰制得的一类氨基多糖，是目前自然界中唯一的碱性多糖，能溶解在某些酸性溶剂中，在体外具有抗菌、消炎、止血、止痛、防黏连、促进愈合、抑制疤痕的作用[1].卡波姆是一种由丙烯酸与烯丙基蔗糖交联而成的高分子聚合物，是一种多用途的高分子材料和优良的药用辅料[2]，被广泛应用于药品、化妆品的研制生产，已在2005年被《中国药典》收载.卡波姆水凝胶的pH为2.5～3.0[3]，无油腻感、易于涂布、对皮肤及黏膜无刺激性、释药快、干后无片屑，是局部药物转运系统的优良基质[4].目前市面上出现了壳聚糖、羧甲基壳聚糖与其他基质复配的外用凝胶或单一的卡波姆释药凝胶产品，也有少量以壳聚糖、卡波姆为基质制作的释药凝胶[5]或缓释片[6]，其工艺均为简单的两种基质直接混合，且目前所用的壳聚糖大多为羧化壳聚糖或虾蟹壳聚糖.目前，利用壳聚糖的药用价值制作的以卡波姆为基质的壳聚糖水凝胶少有研究，以从真菌菌丝和子实体中提取的食用菌壳聚糖为原料的研究更少，壳聚糖与卡波姆的复配工艺对水凝胶质量的影响也几乎没有研究.对于外用凝胶这种经皮给药制剂，有效成分的经皮渗透量是评价功效的重要指标，目前经皮渗透通常在人体皮肤或各种动物皮模型上进行研究，但受性别、年龄、部位、取皮后期处理等的影响，试验数据变异性高、平行性差[7].寻找经皮渗透研究动物皮模型的替代物也至关重要.本试验主要以食用菌壳聚糖、虾蟹壳聚糖、羧化壳聚糖为原料，以卡波姆为辅料，利用壳聚糖的聚阳离子、卡波姆凝胶的聚阴离子电解质的性质，通过两种工艺制备5种聚电解质复合水凝胶，参照《中国药典》(2015年版)凝胶剂的制剂通则要求[8]对复合水凝胶进行定性鉴别及外观特征、粒度、黏度、溶胀度、稳定性、酸碱度、铅离子含量的鉴定；并以食用菌壳聚糖/卡波姆复合水凝胶为对象，以豚鼠皮肤、0.45 μm聚合膜、Strat-MTM皮肤专用膜作为人体皮肤替代物，采用改进的Franz扩散池装置，利用茜素红法、锌试剂法测定壳聚糖经皮累积渗透量，旨在为拓宽壳聚糖/卡波姆水凝胶在日化及医疗器械上的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

供试动物为雄性豚鼠，重180～220 g，由厦门大学动物实验中心提供.

虾蟹壳聚糖(脱乙酰度96.21%，黏度150 mpa·s)、羧化壳聚糖(羧化度85%，黏度40 mpa·s)购自上海源聚生物有限公司；食用菌壳聚糖(脱乙酰度99.9%，黏度100 mpa·s)购自福建科人生物科技有限公司；卡波姆940(青岛天力源生物科技有限公司)、三乙醇胺(西陇化工股份有限公司)、铅(国家有色金属及电子材料分析测试中心)、锌试剂(上海三爱思试剂有限公司)、茜素红(西陇化工股份有限公司)均为分析纯；0.45 μm聚合膜购自北京天安联合科技有限公司；Strat-MTM皮肤专用膜购自默克密理博中国有限公司.

仪器与设备有OLYMPUS IX51数码相差倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社)、HBE-50S闪式提取控制器(西安太康生物科技有限公司)、EL20K实验室pH计(梅特勒—托利多仪器有限公司)、NDJ-9S旋转黏度计(上海上天精密仪器有限公司)、漩涡振荡器(广州科桥实验技术设备有限公司)、Forma 705型超低温冰箱(美国Thermo公司)、SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、UV-3200PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、TK-12D型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司).

1.2 试验设计

1.2.1 特殊工艺型复合水凝胶的制备 取适量超纯水，均匀撒入卡波姆粉末，静置，自然溶胀24 h，制得1.5%卡波姆溶胶Ⅰ；取虾蟹壳聚糖粉末/食用菌壳聚糖溶于1%乙酸(料液比为1∶25)，用三乙醇胺调节pH≥7，抽滤，用超纯水洗至pH<7，用5%乙酸反调至酸性(pH约为6)，得到黏稠状胶状物，补充适量超纯水，均质使其充分混匀，得到光滑细腻的3%壳聚糖凝胶Ⅱ；将凝胶Ⅱ缓缓注入溶胶Ⅰ中充分搅拌(质量比为1∶2)，混合均匀，用三乙醇胺调至pH约为7，充分均质，得到1%壳聚糖/卡波姆复合水凝胶A1、B1(含1%卡波姆)(表1).

1.2.2 直接混合型复合水凝胶的制备 取适量超纯水，均匀撒入卡波姆粉末，静置，自然溶胀24 h，制得1%卡波姆溶胶；卡波姆溶胶与虾蟹壳聚糖粉末/食用菌壳聚糖/片状羧化壳聚糖混匀(质量比为99∶1)，自然溶胀24 h，充分搅拌，混合均匀，用三乙醇胺调至pH约为5.5，得到1%壳聚糖/卡波姆复合水凝胶A2、B2、C(表1).

表1 壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的组成Table 1 Compositions of chitosan/carbomer complex hydrogel

1.3 质量鉴定

参照《中国药典》中凝胶剂的制剂通则要求[8]对本品进行鉴定.

1.3.1 鉴别反应 鉴别反应一：取1 g壳聚糖/卡波姆复合水凝胶，加入10 mL 1%乙酸，搅拌溶解后，滴加2滴甲基橙指示剂，观察溶液的变化.

鉴别反应二：取10 g壳聚糖/卡波姆复合水凝胶，加入50 mL去离子水搅拌后加10 mL 1 mol·L-1盐酸，水浴煮沸加热15 min至样品溶解，冷却至室温，出现白色浑浊物，滤过，滤液滴加10 mL 1 mol·L-1氢氧化钠，观察现象，滴加盐酸数滴，观察溶液的变化.

1.3.2 外观特性 观察壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的色泽、气味、稠度、均匀度、光泽度、涂展性能.

1.3.3 粒度 取壳聚糖/卡波姆复合水凝胶，滴加少量去离子水，于漩涡振荡器中振荡使其正好溶解.取少量液体于载玻片上，涂成薄层，覆以盖玻片，按照粒度测定法[8]，采用OLYMPUS IX51数码相差倒置显微镜检查，要求不得检出大于180 μm的粒子.

1.3.4 黏度 室温下称取50 g壳聚糖/卡波姆复合水凝胶，使用旋转黏度计测定黏度.

1.3.5 溶胀度 准确称取壳聚糖/卡波姆复合水凝胶，置离心管中，先加少量去离子水，置漩涡振荡器中振荡，混合均匀，静置24～48 h，若离心后不析水，则继续往离心管中添加少量去离子水，重复以上步骤，直至静置、离心后析出的水与最后加入的水量相同，表明溶胀已完成.滤去多余水分，用滤纸吸干表面水分，称重.采用文献[9]的方法计算水凝胶的饱和溶胀度(SR).

SR/%=W1-W0W0×100

式中：W0为溶胀前的水凝胶质量(g)；W1为溶胀完全后的水凝胶总质量(g).

1.3.6 稳定性 通过耐热耐寒性检测确定稳定性.壳聚糖/卡波姆复合水凝胶置于100 ℃高压湿热条件下杀菌15 min后取出，置室温观察外观是否变化，水凝胶有无分层现象；再将壳聚糖/卡波姆复合水凝胶置于冰箱(-18 ℃)中放置6 h，取出解冻后，观察外观是否变化，水凝胶有无分层现象.

1.3.7 酸碱度 取10 g壳聚糖/卡波姆复合水凝胶，加入20 g去离子水搅拌5 min至溶解，测定pH.

1.3.8 铅离子含量 参照《中国药典》附录Ⅷ的要求[8]，铅离子含量不得超过10 μg·g-1.

1.4 经皮渗透试验设计

去除豚鼠背部皮肤的腹毛，剪取脱毛部位的皮肤，剔除皮下组织和脂肪，用生理盐水反复冲洗至无白色污浊物，浸于生理盐水中，置冰箱(-70 ℃)中冷藏备用，至少在试验前30 min解冻并浸于生理盐水中，1周内使用.试验前检查鼠皮的完整性，不得有破损.

精密称取0.2 g B1水凝胶均匀涂抹于人体皮肤替代物(0.45 μm聚合膜、Strat-MTM皮肤专用膜、豚鼠皮肤)表面，涂匀后固定在接受池上.在6.5 mL扩散池中盛满磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，使溶液与皮肤替代物完全接触.于37 ℃恒温、300 r·min-1恒速振荡，在一定时间内取样，每次2 mL，同时补充等体积的缓冲液.样品壳聚糖累积渗透量分别采用锌试剂法[10]、茜素红法[11]测定，参照文献[12]的方法计算.

Qn=CnV+∑n-1i=1ViCiA

式中：Qn为累积渗透量(mg·cm-2)；Cn、Ci为第n、i次取样点的药物含量(mg·mL-1)；V为扩散池体积(mL)；Vi为取样液体积(mL)；A为渗透面积(cm2).

1.5 壳聚糖含量的测定

1.5.1 锌试剂法 取1 g食用菌壳聚糖加入100 mL 1%乙酸，磁力搅拌24 h至完全溶解后，定容至100 mL，过滤后取滤液，即为样品溶液；配制一系列含量为0.006 25%～0.05%的食用菌壳聚糖标准溶液；测定时，取2 mL 0.2 mol·L-1NaAc-HAc缓冲溶液(pH 5.0)、1 mL样品溶液，马上按秒表开始计时，然后准确加入2 mL 0.833×10-4mol·L-1锌试剂(ZCN).从加入样品溶液开始计时到30 min时，测定465 nm波长处的光密度(D)，制作标准曲线[10].

1.5.2 茜素红法 采用“1.5.1”的方法配制食用菌壳聚糖的标准溶液.测定时，取1 mL 0.2 mol·L-1NaAc-HAc缓冲溶液(pH 5.0)、2 mL超纯水、1 mL 0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 6.5)、1 mL茜素红操作液、1 mL样品溶液，从加入样品溶液开始计时到30 min时，测定519 nm波长处的D，制作标准曲线[11].

2 结果与分析

2.1 鉴别反应结果

从表2可以看出，在甲基橙的作用下，以水为溶剂的壳聚糖/卡波姆复合水凝胶液呈橙黄色，有少量浑浊物(C水凝胶除外)，以1%乙酸为溶剂的水凝胶液呈橙红色，有大量絮状沉淀.表明水凝胶中有壳聚糖、卡波姆的存在，这是因为壳聚糖/卡波姆复合水凝胶中的卡波姆在一定的酸性条件下会产生絮凝沉淀，壳聚糖的离子强度也会改变水凝胶对pH的敏感性[13-14].颜色深浅除了与壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的pH有关外，还与水凝胶本身的色泽有关.

表2 5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的鉴别反应一结果Table 2 Identification of 5 kinds of chitosan/carbomer complex hydrogels by method 1

在鉴别反应二中，将水凝胶溶解于盐酸中，过滤掉白色浑浊物(卡波姆).从表3可以看出，壳聚糖在碱性条件下出现浑浊物或沉淀，这是壳聚糖在碱性条件下无法溶解的结果，酸性条件下有少量絮凝物沉淀，这与鉴别反应一的结果相似.而食用菌壳聚糖在碱性条件下出现少量沉淀，在酸性条件下出现少量絮状物，说明食用菌壳聚糖与卡波姆(B1、B2)的交联效果比虾蟹壳聚糖(A1、A2)好.

表3 5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的鉴别反应二结果Table 3 Identification of 5 kinds of chitosan/carbomer complex hydrogels by method 2

2.2 质量鉴定结果

研究表明，卡波姆制得的水凝胶涂抹在皮肤上有特别的细腻滑爽感，与皮肤的藕合效果极佳[15].卡波姆遇水溶胀形成酸性黏稠状液体，而壳聚糖只溶解在某些酸性介质中形成胶体黏稠物质，因此二者交联可获得较好的水凝胶.从图1、表4可以看出，除A2水凝胶涂抹后有颗粒感外，其他4种水凝胶均细腻有光泽，易于涂抹，有清凉感.可见：食用菌壳聚糖不管是通过特殊工艺还是通过直接混合型工艺制备水凝胶，都能与卡波姆很好地交联；虾蟹壳聚糖只有通过特殊工艺制备卡波姆水凝胶才具有较好的交联性能，若直接混合，则不能完全与卡波姆交联；而羧化壳聚糖本身是水溶性的，与卡波姆的混合效果好.

从图2、表5可以看出，5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的最大粒径均小于《中国药典》规定的180 μm限量[8].显微镜下发现A2水凝胶分散不均匀，颗粒絮凝感强，结合感官评定结果可以推测虾蟹壳聚糖在该水凝胶制备的过程中并未完全溶解.由表5还可以看出，5种水凝胶的黏度均大于105mPa·s.黏度较大，涂抹在皮肤或黏膜表面具有较好的附着性，可以提高药物的滞留时间，促进皮肤对药物的吸收，增强药物的作用[16].5种水凝胶饱和溶胀度的大小为：B2>A2>C>B1>A1，说明直接混合型水凝胶的溶胀度比特殊工艺型的大；而羧化壳聚糖水凝胶的溶胀度居中，可能是在特殊工艺型水凝胶制备的过程中，壳聚糖经过多次的水洗、抽滤，其溶胀性能降低了.表5还显示，食用菌壳聚糖水凝胶的溶胀度大于虾蟹壳聚糖水凝胶，表明食用菌壳聚糖与卡波姆的交联结构更稳定.耐热耐寒性检测的结果表明，5种水凝胶的外观无明显变化，水凝胶无分层现象，说明以卡波姆作为基质的外用型壳聚糖/卡波姆复合水凝胶具有较好的复配稳定性.5种水凝胶铅离子含量的检测结果均不超过10 μg·g-1，符合《中国药典》的要求[8]；pH呈中性或微酸性，适合人体皮肤使用，符合制作要求.

A1、A2、B1、B2、C为壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的编号.图1 5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的表观状态Fig.1 Appearance states of 5 kinds of chitosan/carbomer complex hydrogels

表4 5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的外观特性Table 4 Appearance characteristics of 5 kinds of chitosan/carbomer complex hydrogels

A1、A2、B1、B2、C为壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的编号.图2 5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的粒径Fig.2 Particle sizes of 5 kinds of chitosan/carbomer complex hydrogels

表5 5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的质量鉴定结果Table 5 Quality identification of 5 kinds of chitosan/carbomer complex hydrogels

2.3 食用菌壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的经皮渗透效果

2.3.1 测定方法对水凝胶壳聚糖累积渗透量的影响 以B1水凝胶为对象，以Strat-MTM皮肤专用膜为皮肤替代物，采用锌试剂法、茜素红法测定壳聚糖累积渗透量.从图3可以看出，茜素红法与锌试剂法的测定数据相当，说明两种方法均适用于水凝胶壳聚糖累积渗透量的测定.此外，随着透皮时间的增加，壳聚糖累积渗透量逐渐升高，说明食用菌壳聚糖/卡波姆复合水凝胶中的壳聚糖释放效果持久.

2.3.2 不同皮肤替代物对水凝胶壳聚糖累积渗透量的影响 采用茜素红法测定B1水凝胶在豚鼠皮肤、0.45 μm聚合膜、Strat-MTM皮肤专用膜的累积渗透量.从图4可以看出，豚鼠皮肤的壳聚糖累积渗透量较低，24 h的累积渗透量仅为0.45 mg·cm-2.这可能是豚鼠皮肤组织中的某些成分改变了反应体系的pH，而壳聚糖含量的测定对体系的pH要求很高，从而影响测定结果；且豚鼠皮肤模型常因部位、个体差异，数据变异性高、平行性差.0.45 μm聚合膜、Strat-MTM皮肤专用膜具有较高的壳聚糖累积渗透量，两者的测定数据相当，均随着透皮时间的增加，累积渗透量逐渐增大，24 h的累积渗透量达到1.2 mg·cm-2左右，约为豚鼠皮肤渗透量的3倍.Strat-MTM皮肤专用膜是一种合成超滤膜，其多层结构设计是模拟人体皮肤的构造，由紧密的表层、中间的多孔渗透层、最下层的无纺纤维层构成，这种新型膜产品在多层结构形式、厚度、多孔渗透性等方面都与人体皮肤极为相似，在经皮渗透研究中具有批次稳定性好、操作简便、容易获得等优点，是专业的透皮给药检测模型.在0.45 μm聚合膜上进行壳聚糖累积渗透研究的结果与Strat-MTM皮肤专用膜相近，可以作为廉价的壳聚糖透皮给药检测模型.

图3 测定方法对壳聚糖累积渗透量的影响Fig.3 Effect of assay method on the cumulative permeability of chitosan

图4 皮肤替代物对壳聚糖累积渗透量的影响Fig.4 Effect of skin substitute on the cumulative permeability of chitosan

3 讨论与结论

目前市面上的壳聚糖产品大多以羧化壳聚糖或虾蟹壳聚糖为原料，虾蟹壳聚糖的缺点是灰分、蛋白含量高，脱乙酰度低，性质较不稳定，抑菌效果较差，对虾蟹过敏者有副作用等[3,17]；而食用菌壳聚糖脱乙酰度高，性质稳定，灰分含量少，抑菌性能优良，不会对使用者产生副作用[3].由于单一的壳聚糖凝胶力学性能差、透气性欠佳，使用性能不好[18]，且只溶解在某些酸性介质中，与其他辅料物理交联困难，容易絮凝成坨，这些因素影响了壳聚糖的应用.卡波姆水凝胶的pH为2.5～3.0，是一种酸性药用辅料，可以溶解壳聚糖形成水溶胶，再加入三乙醇胺与卡波姆中的羧基中和，形成稳定的高分子水凝胶结构，达到增稠和保湿的应用效果.但卡波姆溶胶对壳聚糖的溶解性能有限，本试验中，虾蟹壳聚糖与卡波姆直接混合制得的A2水凝胶中的壳聚糖并没有完全溶解，有颗粒感，限制了壳聚糖效能的释放.而特殊工艺采用一定的方法先将壳聚糖制成中性凝胶，再与卡波姆溶胶混合，三乙醇胺中和，通过闪式破碎技术、乳化均质技术实现食用菌与卡波姆的物理交联，作者前期研究表明，这种方法制备的壳聚糖/卡波姆复合水凝胶稳定性高，抑菌效果好[3].比较两种方法制备的壳聚糖/卡波姆水凝胶及3种来源壳聚糖制备的水凝胶在品质上是否存在差异，是否达到《中国药典》凝胶剂的制剂通则要求[8]，是本试验研究的初衷.本试验结果显示：5种壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的粒径均小于180 μm，黏度大于105mPa·s，具有较高的耐热耐寒性，pH呈中性或微酸性，铅离子含量小于10 μg·g-1，符合《中国药典》的要求[8]，适合人体皮肤使用；除A2水凝胶涂抹有颗粒感外，其他4种均具有稠度适宜、细腻有光泽、易于涂抹、有清凉感、稳定性好、黏滞性好、使用安全等优点；食用菌壳聚糖与卡波姆的交联性好于其他4种水凝胶.经皮渗透试验常用来评价经皮给药制剂药物有效成分的透皮性能，壳聚糖的经皮渗透量一般采用茜素红法、锌试剂法进行检测，利用茜素红或锌试剂与壳聚糖在一定条件下的特异性显色反应，D的变化与壳聚糖含量呈线性关系的特点来测定微量壳聚糖含量，但壳聚糖含量的测定对体系pH要求很高，动物皮肤组织中的某些成分可能会改变反应体系的pH，影响壳聚糖含量的测定结果.采用特殊工艺型制备的食用菌壳聚糖/卡波姆复合水凝胶的经皮渗透试验结果表明：茜素红法和锌试剂法均适用于复合水凝胶中壳聚糖含量的测定；豚鼠皮肤壳聚糖的累积渗透量较低；Strat-MTM皮肤专用膜具有较高的壳聚糖累积渗透量，24 h的累积渗透量为1.22 mg·cm-2，约为豚鼠皮肤渗透量的3倍；0.45 μm聚合膜的壳聚糖累积渗透量与专业的透皮给药检测模型Strat-MTM皮肤专用膜相当，因此可以替代Strat-MTM皮肤专用膜，作为廉价的壳聚糖透皮给药检测模型.