（1，3）-β-D葡聚糖水平在抗菌药物治疗白色念珠菌病疗效中的评价作用

姜月红 李晓林 孙 健 闫 莉 王 彤 尤玉红 金 薇 王 锋 张 超

黑龙江省医院检验科，黑龙江哈尔滨 150000

念珠菌[1]是一种腐物寄生菌，广泛存在于自然界。是人体正常菌群之一，平时主要生存于人体的口腔、皮肤、黏膜、消化道、阴道及其他脏器中。正常人群白色的带菌率可高达40%；从阴道粘膜分离出来的念珠菌85% ～ 90%为白色。以白色的致病性最强。近年来真菌感染的发病率呈现了逐年上升的趋势，以往我们都是通过菌落培养、病理组织等方法进行诊断，但是由于此过程耗时长且敏感度较低，易受外界因素的干扰，目前临床中较少应用。有关文献曾报道，（1，3）-β-D葡聚糖是真菌胞壁的重要组成部分，其指标的高低可能同真菌感染的严重程度有关[2]。因此本实验选择了大鼠作为感染白色念珠菌病的模型，分析血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平同药物疗效间的联系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料与设备

1.1.1 实验大鼠 于2017年9月～2018年5月间选择健康的Wistar大鼠共计90只，小鼠均为6～9周龄，雌雄均可入组，体重180～220g。供应商为长沙市天勤生物技术有限公司[许可证号：SCXK（湘）2014-0011]。将大鼠随机分为治疗组、模型组及对照组，每组各30只。治疗组大鼠雌性16只，雄性14只，平均月龄（7.03±2.31）周，平均体重（200.45±23.31）g；模型组大鼠雌性15只，雄性15只，平均月龄（6.97±2.21）周，平均体重（198.71±22.27）g；对照组大鼠雌性14只，雄性16只，平均月龄（7.12±2.40）周，平均体重（201.02±21.98）g。各组大鼠间月龄、雌雄及体重等一般资料情况间差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。大鼠购回后均经过7d的适应性饲养，减少应激反应的出现。实验前及实验中大鼠均按常规饲养方式喂养。

1.1.2 念珠菌菌种 实验用的白色念珠菌菌种选用杭州微球生物技术有限公司生产的白色念珠菌[菌种编号CMCC（F）98001]。使用时用取规定的稀释液加到冻干菌种球中，混合震荡1min，使其充分溶解。并植于培养基上培养36h，将培养后的菌种经生理盐水稀释后准备使用。

1.1.3 仪器与试剂 氟康唑选用广东逸舒制药股份有限公司生产的氟康唑胶囊（H20066085），规格150mg/粒；微生物快速动态检测系统选用北京金山川科技发展有限公司生产的MB-80E型微生物快速动态检测系统[京药监械（准）字2013第2400896号]；真菌检测试剂盒选用北京金山川科技发展有限公司生产的GKT-5M型试剂盒[国食药监械（试）字2016第3080005号]；培养基选择沙包氏琼脂培养基[粤食药监械（准）字2010第2400119号]；保温箱选用上海印溪仪器仪表有限公司生产的LRH-150SDP 型综合稳定性保温试验箱。

1.2 方法

1.2.1 模型处理 对治疗组和模型组大鼠尾静脉注射浓度7×105的制备好的白色念珠菌悬液2mL，治疗组在模型建立成功后24h经口灌入氟康唑10mg/只，10mg氟康唑用2mL生理盐水制成混悬液灌入，每日两次，分别于用药前、用药后1、3及7d抽取静脉血无菌分离血浆并取活肾组织留检。模型组在相同时间用2mL生理盐水经口灌入，取样时间及方法同治疗组。对照组取样时间同治疗组及模型组。

1.2.2 模型处理[3]取已经无菌肝素钠处理过的静脉一次性采血管抽取大鼠静脉血2mL，灭菌密封后置于离心机中以2000rPm速率离心60s后立即置于冰水浴中，即获得待测血浆。取待测血浆0.5mL置于反应剂中，置于MB-80E型微生物快速动态检测系统进行检测，根据反应后的标准曲线即可得出（1，3）-β-D葡聚糖水平。

在指定时间处死对应大鼠取双肾，制成无菌的匀浆，经10mL生理盐水稀释后取上层清液10μL接种在培养基上，进行培养，24h后测定菌落计数。

1.3 统计学方法

本研究资料录入SPSS16.0进行统计分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。各组数据若符合正态分布，采用方差分析法，组间采用q检验分析；若不服从正态分布则运用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌落计数情况

各组间首先进行方差分析，将具有统计学意义的各项目，分别与对照组进行组间两两比较，用药前显示模型组的念珠菌菌数明显高于对照组（q=9.916，P＜0.05），治疗组的念珠菌菌数明显高于对照组（q=10.731，P＜0.05），说明建模成功，可以进行下一步实验；治疗组念珠菌菌数随治疗天数增加逐渐降低，且在用药后3d开始同模型组间差异具有统计学意义（q=-8.432；q=-10.118；q=-9.992，P＜0.05）。见表1。

表1 不同时间菌落计数情况比较（±s，cFu）

表1 不同时间菌落计数情况比较（±s，cFu）

组别 用药前 用药后1d 用药后3d 用药后5d 用药后7d对照组 0.17±0.25 0.14±0.19 0.21±0.25 0.20±0.31 0.18±0.19模型组 263.41±137.06 289.45±173.96 254.70±182.42 189.89±121.02 107.32±97.32治疗组 271.21±154.91 195.12±140.12 58.19±57.19 7.81±6.01 2.01±1.92 F 14.665 15.876 13.246 16.554 16.348 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平

各组间首先进行方差分析，将具有统计学意义的各项目，分别与对照组进行组间两两比较，用药前显示模型组的血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平明显高于对照组（q=11.682，P＜0.05），治疗组的血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平明显高于对照组（q=11.798，P ＜ 0.05），说明（1，3）-β-D 葡聚糖水平升高反映了真菌感染的存在；治疗组（1，3）-β-D葡聚糖水平随治疗天数增加逐渐降低，且在用药后3d开始同模型组间差异有统计学意义（q=-9.563；q=-9.119；q=-11.928，P ＜ 0.05）。见表 2。

表2 不同时间（1，3）-β-D葡聚糖水平情况比较（±s，mmol/L）

表2 不同时间（1，3）-β-D葡聚糖水平情况比较（±s，mmol/L）

组别 用药前 用药后1d 用药后3d 用药后5d 用药后7d对照组 10.03±7.58 9.79±8.13 10.42±9.37 11.68±8.21 9.12±7.34模型组 4412.21±3190.31 4769.12±3365.28 4012.43±3013.94 3114.54±2832.27 592.23±394.21治疗组 4230.45±3464.20 2630.42±2732.35 739.29±693.04 25.19±17.88 9.29±6.00 F 16.332 21.379 28.546 19.875 21.034 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落计数相关性情况

治疗组用药前、用药后 1、3及 7d血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落计数具有相关性（P ＜ 0.05），模型组以上各时间血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落计数也具有相关性（P＜0.05）。以上结果说明血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平可以反映念珠菌菌落计数情况，可以间接说明药物的疗效情况。见表3。

表3 血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落计数相关性情况

3 讨论

有文献指出[4-5]，白念珠菌感染，首先是粘附在宿主的上皮细胞上，然后在以上所述的白念珠菌致病因素作用下形成感染灶。粘附在上皮细胞是因为宿主细胞膜表面上有白念珠菌的粘附受体，即岩藻糖和N-乙酰葡萄胺[6]；白念珠菌胞壁上具有多种粘附介导体，其中较为重要的有甘露聚糖-蛋白质复合物（M-P）和几丁质[7-8]。几丁质是（1-3，1-6）β-葡聚糖与N-乙酰葡萄糖受化合物而成的立体空间多聚体；白念珠菌胞壁具有纤维蛋白原，纤维连接蛋白等成分的粘着受体[9]。说明（1，3）-β-D葡聚糖水平同真菌感染间存在着十分密切的联系[10-11]。因此本文研究（1，3）-β-D葡聚糖水平同药物治疗白色念珠菌病疗效间的关系，以此确定药物的疗效情况。

本研究结果显示：用药前显示模型组及治疗组的菌落计数及血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平明显高于对照组，说明（1，3）-β-D葡聚糖水平升高反映了真菌感染的存在；治疗组（1，3）-β-D葡聚糖水平及菌落计数随治疗天数增加逐渐降低，且在用药后3d开始同模型组间具有统计学差异，说明抗菌药物药物氟康唑疗效显著。治疗组及模型组各时间血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落计数具有相关性。这些指标为早期诊断真菌性血流感染提供一定的参考价值，且各指标的水平高低与疾病的严重程度呈正相关。本研究结果说明血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平可以反映念珠菌菌落计数情况，可以间接说明药物的疗效情况然而在实际临床检验中[12]，也可能出现血浆（1，3）-β-D葡聚糖水平异常升高或降低而同白色念珠菌病间并无关系的情况[13]：比如说产时间透析患者的透析膜中所含的葡聚糖可能造成检验指标升高，某些免疫缺陷患者体内的特有厚细胞膜的隐球菌可能造成检验指标降低[14-15]。因此在临床中应视具体情况具体分析。

综上所述，（1，3）-β-D葡聚糖水平可以反映白色念珠菌病的感染程度，同时可以对抗菌药物的疗效做出评价，为临床的进一步治疗提供帮助。