N-乙酰半胱氨酸对膜性肾病大鼠肾脏的保护作用

杨琳琳 王玉洁 刘刚 程闰夏 彭素英 曹灵

1西南医科大学附属医院肾病内科（四川泸州646000）；2北京大学第一医院肾病内科/北京大学肾脏疾病研究所（北京100034）；3重庆市涪陵中心医院（重庆408000）

膜性肾病（membranous nephropathy，MN）是成人肾病综合征最常见的病理类型，约占33%，在中老年患者中比例更高。全世界范围内，每年约有10万例新发病例［1］。近年来，我国MN发病率呈明显增加趋势［2］，其诊治正受到广泛重视。

经过半个多世纪的深入研究，目前已知MN发病机制的核心环节是肾小球足细胞下免疫复合物形成、激活补体导致足细胞损伤和基底膜改变，后期随着肾小球的严重损伤，肾小管出现萎缩，肾间质淋巴细胞和单核细胞浸润、纤维化，最终导致整个肾脏受损。氧化应激和内质网应激可促进足细胞在内的多种肾脏固有细胞的损伤，参与多种肾脏疾病发病及恶化［3-6］，但它是否参与MN的进程以及有效拮抗是否能起到减轻疾病的症状目前尚未有报道。MN是一组发展缓慢、病程迁延的疾病，自然预后差别大，约30%可自行缓解，约50%的患者可在10～20年内进展至终末期肾病［7］。最新国际指南的治疗建议［8］是：先保守治疗6个月，未获得自发缓解，再予以糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗。而在这一治疗过程中，如果能找到方便临床使用的有效的治疗新选择也是一件非常有意义的工作。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一种含有巯基的化合物，有黏液溶解作用，作为祛痰药广泛应用于临床。它同时具有干扰自由基产生、清除已形成的自由基、抗细胞凋亡、调节免疫等作用［9］。已有少量研究显示NAC可降低内质网应激水平，改善醛固酮诱导的肾小管上皮细胞的凋亡［10］；NAC也可降低氧化应激水平，减少糖尿病大鼠足细胞凋亡［11］。但在MN动物模型中系统观测NAC疗效及机理尚缺乏专门报道。本研究应用阳离子化牛血清白蛋白制备大鼠MN模型，观察内质网应激和氧化应激的参与情况，以及NAC是否通过相应的拮抗起到对MN大鼠肾脏的保护作用，以期为MN的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂N-乙酰半胱氨酸（海南赞邦制药有限公司，批号：H20080326，规格：600 mg/片），兔抗TRAF2多克隆抗体、兔抗Caspase12多克隆抗体（美国Bioworld公司，批号：BS6065、BS3542），兔抗WT-1多克隆抗体（英国Abcam，批号：ab15249），兔抗大鼠IgG抗体、异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG抗体、二步法免疫组化试剂盒（中国北京中杉金桥公司，批号：ZB-2040、ZF-0311、SP-9001），MDA（中国武汉纯度生物公司，批号：CDY-2566X-SJH），SOD（中国上海晶抗生物工程公司，批号：JKSJ-1821），TUNEL试剂盒（中国江苏凯基生物公司，批号：KGA-701-TY1163），制备的不完全弗氏佐剂、制备的阳离子化牛血清白蛋白。

1.1.2 实验动物实验动物为北京斯贝福生物技术有限公司提供的体质量为（120±20）g的健康，SPF级，雄性SD大鼠 80只。生产许可证：SYK（京）2016-0002，使用许可证：SYK（川）2014-001。动物实验的开展取得了西南医科大学实验动物伦理委员会批准（动物伦理编号：20170100007）。屏障环境饲养，自由饮水、进食，适宜温度、湿度。

1.2 研究方法

1.2.1 造模、分组与给药采用阳离子化牛血清白蛋白制备MN大鼠模型［12］，随机分为4组：正常组（Control组）、模型组（MN组）、NAC100 mg/kg治疗组（NAC1组），NAC 200 mg/kg（NAC2组）。应用阳离子化牛血清白蛋白（1 mg/0.5 mL生理盐水，加等量不完全弗氏佐剂乳化）隔日腹股沟区、腋下等皮下多部位注射进行预免疫1周，而后采用阳离子化牛血清白蛋白（20 mg/kg）尾静脉注射进行正式免疫，每周注射3次后休息1 d，连续4周，共注射12次。模型组每次尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白后给予生理盐水1mL/d灌胃，NAC1组每次尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白后给予NAC 100 mg/kg灌胃，NAC2组每次每次尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白后给予NAC 200 mg/kg灌胃。

1.2.2 尿蛋白及生化指标检测分别于正式免疫后第1、2、3、4周末收集各组大鼠24 h尿液。各组大鼠于正式免疫后第1、2、3、4周末各取5只处死，用1%戊巴比妥（100 mg/kg）0.5 mL腹腔注射麻醉后，心脏取血。血液和尿液行2 500 r/min离心15 min，收集上清液。采用双缩脲法检测24 h尿蛋白定量，全自动生化仪检测血肌酐、血尿素氮、白蛋白。

1.2.3 肾组织病理学检查肾组织经中性甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，PASM染色观察肾组织病理学变化。间接免疫荧光法观察肾小球IgG沉积情况，电镜下观察上皮下免疫复合物沉积、足细胞形态变化。免疫荧光结果判定：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）清楚可见；（++）荧光明亮；（+++至++++）荧光闪亮。

1.2.4 TUNEL法检测肾脏固有细胞凋亡取4 μm石蜡切片脱蜡水化，蛋白酶K修复，3%H2O2室温封闭，TdT酶反应液，氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。阳性染色半定量分析：每张切片在400倍视野下随机观察10个非重复非硬化的肾小球，肾脏实质细胞胞核棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，计算肾组织TUNEL阳性细胞比例（阳性细胞个数/有核细胞总数），取其平均值计为肾脏固有细胞凋亡指数，以百分数表示［13］。

1.2.5 免疫组化检测肾组织WT⁃1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表达采用免疫组化二步法检测肾组织 WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表达。取4 μm石蜡切片脱蜡水化，EDTA高压修复，3%H2O2室温封闭，分别加入兔抗WT-1抗体（1∶500）、兔抗GRP78抗体（1∶500）、兔抗TRAF2抗体（1∶500）、兔抗Caspase12抗体（1∶500），4 ℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，封片，镜检。阳性结果判断：GRP78、TRAF2、Caspase12以肾实质细胞胞浆内棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，WT-1是足细胞特征性标记，以细胞核棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。阳性染色半定量分析：（1）GRP78、TRAF2、Caspase12 每张切片在400倍视野下随机选取10个视野，采用Image Pro Plus7.0图像分析处理系统，分别测出各指标的阳性区积分光密度及阳性区测量面积，两者相除后即得到平均积分光密度，并用平均积分光密度表示GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白相对含量，每张切片的10个视野的平均积分光密度值平均后纳入统计分析［14］。（2）WT-1 在400倍显微镜下观察10个非硬化肾小球，阳性细胞比例（阳性细胞个数/有核细胞总数），并用阳性细胞比例表示WT-1蛋白相对含量，每张切片的10个视野的WT-1阳性细胞比例平均值纳入统计分析［13］。

1.2.6 血浆SOD、MDA检测采用WST法检测血浆超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），采用tba法检测血浆丙二醛（malondialdehyde，MDA）。按照试剂盒说明操作，分别在532 nm和450 nm酶标仪处测量测定MDA和SOD吸光光度值，并计算出SOD（U/mL）及MDA（nmol/mL）含量。

1.3 统计学方法符合正态分布计量资料以均值±标准差表示，运用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布及方差齐性检验时，采用单因素方差分析进行多组间比较；方差不齐时，采用非参数检验的Kruskal-WallisH方法。实验至少重复3次，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NAC治疗减轻MN大鼠肾病综合征严重程度与正常组相比，模型组从第2周末开始24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮升高（P＜0.05），血白蛋白降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，NAC治疗组从第3周末开始，24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮显著降低（P＜0.05），血白蛋白显著升高（P＜0.05）。NAC1组和NAC2组比较，各项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 NAC治疗减轻MN大鼠肾脏病理损伤程度正常组病理改变无明显异常。免疫荧光见模型组IgG呈强阳性（++++），沿肾小球毛细血管袢和系膜区颗粒样沉积；NAC治疗组，IgG荧光强度相对较弱（均为++），沉积部位同前者。光镜见模型组大鼠肾小球基底膜弥漫性增厚，可见少量“钉突”形成（红色箭头所示）；NAC治疗组除不见“钉突”外，其他与之未见明显差别。电镜见模型组肾小球足细胞下大量电子致密物沉积（蓝色箭头所示），足突弥漫性融合；NAC治疗组与之比较，足细胞下电子致密物沉积都显著减轻。NAC1组和NAC2组比较，上述各种病理损伤程度均无明显差异。

图1 各组大鼠24 h UTP、BUN、Scr、ALB水平Fig.1 The level of 24 h UTP、BUN、Scr、ALB

图2 第4周末各组大鼠肾脏组织病理改变Fig.2 Pathological changes in kidney at the end of the 4th week

2.3 NAC治疗减少MN大鼠肾脏固有细胞凋亡与正常组比较，模型组从第1周末开始，肾脏固有细胞凋亡增加（P＜0.05）。与模型组比较，NAC治疗组从第3周末开始肾脏固有细胞凋亡显著减少（P＜0.05）。NAC1组和NAC2组，肾脏固有细胞凋亡差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3，表1。

图3 第4周末各组大鼠肾脏TUNEL染色（400×）Fig.3 TUNEL staining of kidney at the end of the 4th week（400 ×）

表1 不同时间点各组肾脏固有细胞凋亡指数Tab.1 The index of renal apoptosis in each group at different time points ±s

表1 不同时间点各组肾脏固有细胞凋亡指数Tab.1 The index of renal apoptosis in each group at different time points ±s

注：Control，正常组；MN，膜性肾病组；NAC1，N-乙酰半胱氨酸100 mg/kg治疗组；NAC2，N-乙酰半胱氨酸200 mg/kg治疗组；与同期Control组比较，*P＜0.05；与同期MN组比较，▲P＜0.05

时间第1周第2周第3周第4周Control组0.521±0.192 0.533±0.183 0.556±0.252 0.543±0.154 MN组1.440±0.243*2.901±0.874*4.052±0.912*5.253±1.503*NAC1组1.363±0.254*2.600±0.794*3.216±0.872*▲3.432±0.964*▲NAC2组1.294±0.321*2.283±0.820*3.061 ± 0.872*▲3.271 ± 1.141*▲

2.4 各组大鼠肾组织WT⁃1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白动态表达 与正常组相比，从第1周末开始，模型组肾组织GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表达显著增加（P＜0.05），WT-1蛋白表达显著减少（P＜0.05）。与模型组比较，NAC治疗组从第3周末开始，肾组织中GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表达较少（P＜0.05），WT-1蛋白表达较多（P＜0.05）。与NAC1组比较，NAC2组GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白表达较少，WT-1蛋白表达较多，但各时间点二者差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

表2 不同时间点各组大鼠肾组织WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白相对表达Tab.2 Protein relative expression of WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12 in kidney at different time points x±s

表2 不同时间点各组大鼠肾组织WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12蛋白相对表达Tab.2 Protein relative expression of WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12 in kidney at different time points x±s

注：Control，正常组；MN，膜性肾病组；NAC1，N-乙酰半胱氨酸100 mg/kg治疗组；NAC2，N-乙酰半胱氨酸200 mg/kg治疗组；与同期Control组比较，*P＜0.05；与同期MN组比较，▲P＜0.05

Caspase12 0.003±0.001 0.017±0.004*0.014±0.008*0.015±0.004*0.006±0.002 0.047±0.010*0.038±0.008*0.036±0.009*0.004±0.003 0.077±0.012*0.037±0.011*▲0.033±0.009*▲0.007±0.002 0.142±0.004*0.067±0.011*▲0.051±0.021*▲时间第1周第2周第3周第4周组别Control组MN组NAC1组NAC2组Control组MN组NAC1组NAC2组Control组MN组NAC1组NAC2组Control组MN组NAC1组NAC2组WT-1 31.990±2.501 23.030±2.070*26.791±3.781*26.352±3.213*30.593±2.251 22.862±3.993*23.442±3.441*24.573±3.562*29.794±3.851 15.793±3.322*21.104±4.351*▲22.844±6.382*▲29.454±3.563 7.343±2.523*16.612±2.043*▲17.883±5.354*▲GRP78 0.003±0.001 0.011±0.004*0.009±0.002*0.008±0.002*0.006±0.004 0.021±0.005*0.018±0.003*0.017±0.004*0.007±0.002 0.031±0.005*0.026±0.005*▲0.025±0.004*▲0.005±0.002 0.039±0.005*0.028±0.004*▲0.027±0.006*▲TRAF2 0.002±0.001 0.006±0.001*0.004±0.001*0.005±0.002*0.008±0.005 0.017±0.004*0.015±0.003*0.016±0.002*0.007±0.002 0.025±0.007*0.019±0.004*▲0.018±0.005*▲0.005±0.003 0.041±0.008*0.029±0.007*▲0.027±0.004*▲

图4 各组大鼠WT-1、GRP78、TRAF2、Caspase12免疫组化（400 ×）Fig.4 Immunohistochemical staining charts of WT-1，GRP78，TRAF2 and Caspase 12

2.5 各组大鼠血浆SOD、MDA的动态表达与正常组相比，从第2周末开始，模型组血浆SOD降低（P＜0.05），血浆MDA升高（P＜0.05）。与模型组比较，NAC治疗组从第3周末开始，血浆SOD相对较高（P＜0.05），血浆MDA相对较低（P＜0.05）。NAC1组和NAC2组比较，各项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组大鼠血浆SOD、MDA动态表达Fig.5 Dynamic expression of plasma SOD and MDA

3 讨论

MN是成人肾病综合征最常见的病理类型之一，约50%的患者可在10～20年内发展为终末期肾病，严重威胁人类健康。糖皮质激素联合免疫抑制剂虽然可以获得约80%的缓解率，但副作用比较大，有时甚至会危及患者的生命安全。因此，目前的国际指南建议，使用免疫抑制剂前应有半年临床观察期，期间选用血管紧张素Ⅱ的拮抗药物，虽然避免了免疫抑制剂的副作用，但患者大多会经历更漫长的肾病症状。为此，阶段探索其他类型的有效药物，更好地向临床转化，减轻患者的病痛，具有现实价值。

当机体受到严重损伤，氧化应激将普遍参与其中，而在细胞水平，内质网应激也是细胞生理功能紊乱的典型反应之一，同时反过来加重对细胞的病理损害。以往的研究者已在体外培养的各种肾脏细胞及多种动物模型中，报道了内质网应激和氧化应激参与肾脏疾病的发生与进展［15-17］。本研究首次利用阳离子化牛血清白蛋白诱导的大鼠MN模型，较为系统地观察了内质网应激与氧化应激的作用，观察到随着MN模型的进展，内质网应激的标志性蛋白GRP78表达增多，激活了它诱导细胞凋亡的主要途径之一的TRAF2蛋白的表达，并进而导致下游的Caspase12蛋白增加。而Caspase12可以引起胞浆内钙离子失衡，最终使细胞凋亡［18-20］。本研究也进一步观察到模型组肾脏固有细胞凋亡比例明显增加，通过WT-1免疫组化染色证实足细胞数量减少，即可能源于凋亡。本研究还设计了用抗氧化药物NAC拮抗内质网应激，观察是否能起到肾脏保护的作用，发现其对上述变化的反方向调节作用，表明NAC能通过降低内质网应激，减少肾小球固有细胞凋亡（特别是足细胞的凋亡）起到降低蛋白尿、保护肾功能的作用。同时，本研究还观测到模型组大鼠，血浆SOD下降、MDA升高，提示存在全身的氧化应激状态，NAC治疗组上述变化较轻，差异有统计学意义。说明NAC同时还可能通过拮抗全身的氧化应激状态，从而降低被牛血清白蛋白诱导的异常自身免疫，使得致病的IgG在肾小球内沉积减少，而起到减轻肾病的作用。这正与本研究中免疫病理观测到的现象相一致。本研究中，NAC1组和NAC2组使用的剂量分别是100和200 mg/kg，相当于人体使用剂量的5和10倍，符合动物药理研究的一般原则，两组间的肾脏保护作用没有显著差别，说明这个剂量范围内都具有疗效，但需要在今后的研究中扩大剂量范围以进一步明确量效关系。另外，本实验采用阳离子化牛血清白蛋白诱导的大鼠MN模型原因是除了成模率高、模型稳定外，更主要的是考虑到MN病因多种多样，目前没有与人类MN相同的模型，而近年来有报道在部分儿童MN中发现牛血清白蛋白是致病抗原，可能源于肠道屏障功能异常导致牛奶中此类蛋白进入人体致病［21］。因此，这一模型能更真实地模仿这一情况，为临床筛选有效的药物提供方便有效的平台。本研究选做研究干预的药物NAC作为化痰药已在临床广泛使用，只是未作为抗氧化药物用于肾脏病的治疗，本研究的这一初步的新发现可以作为参考，为今后设计临床试验打下基础，更好地为实现目前国家的转化医学战略服务。

综上所述，本研究发现，在阳离子化牛血清白蛋白的诱导的MN大鼠模型中，有内质网应激和氧化应激的参与；NAC通过对抗内质网应激减少肾脏固有细胞凋亡及全身氧化应激降低异常免疫起到降低尿蛋白、改善肾功能、延缓进展的肾脏保护作用。NAC为代表的抗氧化剂有望成为辅助治疗并延缓MN进展的一种新的临床治疗策略。