热性惊厥患儿核因子-κB和神经元特异性烯醇化酶与脑损伤、心肌损伤的关系

郝改领 张中馥 张楠 徐丽娟 贾系群 郑少敏

河北医科大学附属河北省儿童医院急诊科（石家庄050031）

热性惊厥（febrile convulsion，FC）是一种儿科最为常见的惊厥类型，多发生在感染性疾病，特别是呼吸道感染，患儿体温上升到38℃以上后可能会出现惊厥［1］。小儿热性惊厥一般预后较好，但也可能会出现脑损伤、心肌损伤等多种并发症。多次发作、发作时间过长、发作时体温较低等，都是造成患儿预后不良的危险因素。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种参与细胞凋亡、细胞分化、炎症反应等多种生理病理过程的重要因子［4］，其作用在癫痫、心肌缺血再灌注等疾病中都深入研究，但其在小儿高热惊厥中的研究极为少见。神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）是一种评估神经元受损程度的指标，被广泛应用在神经损伤程度的评估中［3-6］，但其在小儿高热惊厥中的研究不多。本研究分析了热性惊厥患儿NF-κB和NSE的表达与脑损伤、心肌损伤的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年3-月，在我院急诊科诊断为单纯性热性惊厥的患儿共51例，年龄6个月～7岁，平均（3.19±1.83）岁，其中男24例，女27例，纳入单纯性热性惊厥组（SFS组）；选取同期诊断为复杂性热性惊厥的38例患儿，纳入复杂性热性惊厥组（CFS组），年龄6个月～6岁，平均（3.64± 2.08）岁，男20例，女18例。纳入标准：（1）患儿符合2016版《热性惊厥诊断治疗与管理专家共识》中单纯性热性惊厥或复杂性热性惊厥的诊断标准［6］；（2）本次发病为首次发病；（3）患儿无神经系统及心血管系统相关疾病；（4）患儿家长了解并自愿参加本次研究，签署知情同意书。排除标准：（1）患者既往或合并有癫痫、脑部肿瘤占位、智力发育异常或其他神经精神疾病病史；（2）患儿合并有其他器官、组织等重大疾病、恶性肿瘤等；（3）患儿有脑脊液检查禁忌证；（4）患儿家属不同意参与本次研究。另外选取同期在我院急诊科高烧就诊考虑脑膜炎，但后确诊为急性上呼吸道感染的患儿共37例纳入对照组，其中男18例，女19例，年龄6个月～7岁，平均（3.23±1.99）岁。3组患儿的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），可以进行研究比较。本次研究经我院伦理委员会审核通过。

1.2 方法热性惊厥患儿在惊厥发作后24 h内抽取静脉血和脑脊液各3 mL，而对照组患儿则在入院后3 h内抽取静脉血和脑脊液。所有样品均采用低速离心法，分离血清和血细胞，分布置于-80℃冰箱保存。运用电化学发光法，采用LIAISON全自动免疫分析仪（拜耳，德国）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）测定试剂盒（北京科美生物技术有限公司）测定受试者血液和脑脊液中NSE的表达水平。采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测受试者脑脊液中神经因子脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和EF手型钙结合蛋白（SI00B）的表达水平。BDNF检测采用上海远慕生物科技优先公司提供的试剂盒，而SI00B检测试剂盒由北京奥维亚生物技术有限公司提供。采用贝克曼Olympus AU2700全自动生化分析仪和南京波音特生物科技有限公司提供的心肌酶谱系列检测试剂盒检测受试者血液中心肌酶谱的表达水平，包括磷酸激酶同工酶（creatine phosphokinase-Mb，CK-MB）和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）。而NF-κB表达量则通过实时定量荧光聚合酶链锁反应（realtime quantitative polymerase chain reaction，qRTPCR）进行检测，运用全血RNA快速提取试剂盒（Progema）从样品血细胞中提取RNA，随后使用反转录试剂盒（Takara）将提取到的RNA反转录为cDNA，最后使用SYBR-GREEN荧光定量试剂盒（Bio-Rad）在ViiA-7 Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）上以GAPDH为参照，进行相对定量计算分析，每个样品做3个重复孔。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequencing

1.3 观察指标比较不同组患儿血液和脑脊液中NF-κB、NSE水平及脑脊液中神经因子和血液中心肌酶谱的水平。同时分析热性惊厥患儿血清NSE和NF-κB水平与神经因子BDNF和心肌酶谱CKMB水平之间的关系。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差的形式表示，3组均数的比较采用one-way ANOVA分析，每两组均数的比较采用LSD-t检验；计数资料采用频数（率）的形式表示，组间采用卡方检验进行比较。相关性分析采用Pearson′s相关性分析。以P＜0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 各组患儿NF⁃κB、NSE、神经因子及心肌酶谱表达水平比较3组患儿的脑脊液和血液中NF-κB和NSE的表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05），CFS组的上述指标均为最高。但对照组和SFS组患儿脑脊液NSE的水平差异无统计学意义（P＞0.05）。3组患儿脑脊液的神经因子水平和血液心肌酶谱指标差异均有统计学意义（P＜0.05），且CFS组最高，对照组最低。见表2。

表2 各组患儿NF-κB、NSE、神经因子及心肌酶谱表达水平比较Tab.2 Comparison of the expression level of NF-κB，NSE，nerve factors and myocardial enzymes expression in different groups

2.2 血液或脑脊液NSE和NF⁃κB表达水平与神经因子和心肌酶谱指标之间的相关性分析将所有受试者的相关指标进行相关性分析可见，血液中NSE和NF-κB水平呈正相关（R=0.532，P=0.007）而脑脊液中二者水平也成正相关（R=0.693，P＜0.001）。患儿脑脊液中NF-κB的水平与患儿脑脊液中神经因子BDNF和SI00B水平均成正相关（R=0.710，P＜ 0.001；R=0.422，P＜ 0.001）。而患儿血液中NF-κB水平与患儿心肌酶谱CK-MB和LDH水平亦呈正相关（R=0.454，P＜0.001和R=0.582，P＜0.001）。见图1。

图1 血液或脑脊液NSE和NF-κB表达水平与神经因子和心肌酶谱指标之间的相关性分析Fig.1 Correlation analysis between NSE or NF-κB expression in serum and cerebrospinal fluid and nerve factors or myocardial enzymes

3 讨论

FC是一种常见的儿科疾病，多见于年龄6个月～3岁的幼儿，常常发生于上呼吸道感染或其他感染性疾病后，往往在惊厥前患儿体温已上升到38℃以上且已排除颅内感染或其他可能导致惊厥的器质性病变或代谢疾病［7］。该病的发病机制目前尚不明确，大部分患儿一般预后良好，但该病的复发率较高，且部分患儿由于多次发作后可能会转为癫痫。目前的研究表示，患儿的发病年龄越小、发作时体温越低、发作时间越长、次数越多等，都会导致较差的预后［8］。除了脑损伤外，近来的研究也提出患儿在热性惊厥发作期间会出现电解质紊乱、血糖紊乱、心肌酶谱指标异常等，提示热性惊厥患儿在发作过程中可能发生心肌细胞损伤［9］。既往的研究和本次研究均表明复杂性热性惊厥患儿的神经因子表达水平和心肌酶谱相关指标均高于单纯性热性惊厥患儿及普通上呼吸道感染患者。但目前，对其中可能存在的机制目前仍不十分明确。

NF-κB是一种重要的核转录因子，其参与调节细胞中很多重要的生理功能，包括细胞凋亡、细胞繁殖、肿瘤生成、炎症反应等［10］。目前的研究已经证实NF-κB在癫痫的发生发展中起到重要作用［11］，而热性惊厥患儿亦有发展为癫痫的可能。因此，本研究就热性惊厥患儿外周血中NF-κB的表达水平进行了研究，实验结果证实热性惊厥患儿外周血中NF-κB水平显著上呼吸道感染患儿，且复杂性热性惊厥患儿的NF-κB表达水平较单纯性热性惊厥更高。

NSE作为一种神经细胞损伤的标志物，被广泛应用于预测相关神经系统疾病的预后情况。癫痫患者发作后外周血中NSE水平显著上升［12］，而研究表明热性惊厥患儿发作后脑脊液和外周血中的NSE水平均有上升，且复杂性热性惊厥患儿的NSE水平更高，提示患儿的脑细胞受到一定的损伤，损伤程度与惊厥发生的严重程度呈正相关。除NSE外，BDNF作为一种参与神经细胞功能维持和修复的重要蛋白，SI00B蛋白作为一种星形胶质细胞的激活标志，均可用做评估脑损伤的标志［13］。BDNF更参与了NF-κB信号通路的调控［14］。本研究证实在高热惊厥患儿中NF-κB的表达水平与BDNF和SI00B呈正相关。因此，NF-κB和NSE均可作为评估高热惊厥患者脑损伤的标志。

此外，NF-κB也被证实参与心肌细胞损伤及心肌缺血再灌注等生理病理功能，其调控心肌中某些炎性因子，如白细胞介素8、肿瘤坏死因子-α等的释放，激活了热休克蛋白的表达，激活下游细胞凋亡基因Bcl-2等［15］。本研究结果也提示患儿NF-κB表达水平与患儿心肌酶谱中CK-MB和LDH指标呈正相关。因此，NF-κB也可用于评估患儿的心肌细胞损伤程度。

综上所述，热性惊厥患儿NF-κB和NSE的表达水平与患儿脑损伤和心肌损伤水平呈正相关，可以考虑作为热性惊厥患儿脑损伤和心肌损伤的评估标志物。但因为本次研究的样本量有限，研究结论仅供参考，最终结论有待多中心大样本的临床研究。