结肠癌转移相关因子-1、肝细胞生长因子和C-met信号通路在子宫内膜异位症中的表达

骆婕 郭妹 吴瑾柔 陶莹

广东药科大学附属第一医院1妇产科，2病理科（广州510080）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMS）是子宫内膜组织在子宫体以外的部位出现并生长，简称内异症，主要以下腹痛、痛经和不孕为主要症状，在育龄期妇女中发病率为10%［1］。EMS是一种良性疾病，但具有浸润、增殖、转移等类似恶性肿瘤的生物学行为［2］。尽管关于EMS的研究较多，但异位子宫内膜转移和浸润的相关病理生理机制至今仍未阐明。结肠癌转移相关因子-1（metastasisassociated in colon cancer-1，MACC1）是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和C-met信号通路中met基因的关键调节因子，在结肠癌、胃癌等恶性肿瘤的组织中表达增强，与肿瘤细胞的转移密切相关［3］。目前，有关MACC1及其参与的HGF/C-Met信号通路在EMS方面的研究尚未公开报道。本研究通过检测MACC1，HGF及其受体C-met蛋白在子宫内膜异位症中的表达，探讨其与子宫内膜异位症的关系及机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2017年7月至2017年12月在广东药科大学附属第一医院妇科行腹腔镜检查诊断子宫内膜异位症40例，按照ASRM进行分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期12例，Ⅲ期9例，Ⅳ期13例，分别取异位内膜组织及在位内膜组织（增生期）；同期因输卵管性不孕行宫腹腔镜联合检查术（腹腔镜排除EMS）患者的子宫内膜活检组织20例为对照组（增生期）。观察组年龄26～44岁，平均（34.70±3.84）岁，对照组年龄段为27～38岁，平均（33.50±2.89）岁，经比较差异无统计学意义（t=1.232，P=0.223）。本研究通过伦理委员会审查且所有研究标本的收集均取得患者的同意，并重新给予病理阅片。

1.2 主要仪器和试剂蛋白电泳仪（美国BioRad公司）；兔抗人MACC1多克隆抗体（美国Sigma公司）、兔抗人HGF、C-met多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），鼠抗人β-actin单克隆抗体（上海康成生物科技有限公司）；ECL试剂盒（武汉艾捷科技有限公司）。

1.3 实验方法（Westernblot） 用蛋白裂解液收集并提取组织总蛋白，采用Bradford法进行蛋白定量测定，加入10%SDS-PAGE电泳，蛋白样品湿转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2 h，4 ℃下分别用MACC1、HGF、C-met、β-actin（内参）孵育过夜，室温下二抗孵育2 h，ECL试剂反应后曝光，图像扫描后采用Image Pro Plus 6.0软件用比较分析特异性蛋白条带灰度值。

1.4 统计学方法采用统汁学软件包SPSS 19.0进行统计分析，均数用表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，相关性采用spearman相关性检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MACC1、HGF和C⁃met蛋白在不同内膜中的表达在不同内膜组织中，MACC1、HGF和C-met蛋白表达呈现异位内膜＞在位内膜＞对照组内膜两两比较差异均有统计学意义（表1、图1）。

表1 MACC1、HGF和C-met蛋白在各组中的表达Tab.1 Expressions of MACC1 HGF and C-met proteins in different endometrial tissues x±s

表1 MACC1、HGF和C-met蛋白在各组中的表达Tab.1 Expressions of MACC1 HGF and C-met proteins in different endometrial tissues x±s

例数40 40 20组织异位内膜在位内膜对照组内膜F值P值MACC1 0.65±0.14 0.34±0.12 0.03±0.01 195.02＜0.05 HGF 0.86±0.09 0.43±0.08 0.10±0.03 704.05＜0.05 C-met 0.71±0.14 0.42±0.05 0.09±0.03 269.07＜0.05

图1 MACC1、HGF和C-met蛋白在不同内膜组织中的表达（western blot）Fig.1 Expressions of MACC1 HGF and C-met proteins in different endometrial tissues（western blot）

2.2 EMS中，MACC1、HGF和C⁃met蛋白表达相关性经Spearman相关性检验，在子宫内膜异位症中MACC1蛋白的异常高表达与HGF和C-met蛋白的异常高表达呈正相关（r=0.750，P=0.000；r=0.539，P=0.000），HGF蛋白与C-met蛋白表达呈正相关（r=0.647，P=0.000）。见图2。

2.3 EMS不同ARSM分期中MACC1、HGF和C⁃met蛋白分别在在位内膜组及异位内膜组中的表达在EMS的在位内膜及异位内膜组中，MACC1、HGF和C-met蛋白的表达在Ⅰ期与Ⅱ期中差异无统计学意义（P＞0.05），但Ⅲ期中表达较Ⅰ/Ⅱ期明显升高，Ⅳ期中的表达较Ⅲ期更高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

图2 MACC1与HGF和C-met蛋白的表达的相关性分析Fig.2 The correlation analysis among MACC1 HGF and C-met protein

表2 MACC1、HGF和C-met蛋白在EMS不同分期中的表达Tab.2 The Expression of MACC1，HGF and C-met proteins in different stages of EMS x±s

表2 MACC1、HGF和C-met蛋白在EMS不同分期中的表达Tab.2 The Expression of MACC1，HGF and C-met proteins in different stages of EMS x±s

在位内膜组异位内膜组例数6 12 9 13 ARSM分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期F值P值MACC1 0.23±0.06 0.24±0.05 0.35±0.02 0.48±0.08 38.36＜0.05 HGF 0.35±0.09 0.37±0.04 0.44±0.02 0.51±0.05 23.49＜0.05 C-met 0.37±0.05 0.38±0.03 0.43±0.01 0.48±0.03 33.12＜0.05 MACC1 0.52±0.12 0.55±0.07 0.67±0.03 0.79±0.09 25.19＜0.05 HGF 0.79±0.05 0.79±0.04 0.86±0.01 0.96±0.07 31.78＜0.05 C-met 0.59±0.12 0.59±0.11 0.72±0.04 0.86±0.05 28.86＜0.05

MACC1位于人类第七号染色体（7p21.1），2009年由STEIN学者在结肠癌组织中发现并命名，参与结肠癌的发生发展，与疾病的转移进展密切相关［4］。近年来，多项研究显示，MACC1不仅是结肠癌转移的相关指标，也与胃癌、肺癌等多种组织来源的恶性肿瘤转移密切相关［5-6］。随着研究的不断深入，MACC1还被证实与子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌等妇科恶性肿瘤有相关性，MACC1的表达与肿瘤的转移具有正相关性［7-8］。本研究是通过Western blot检测MACC1蛋白在子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜组织中的表达情况，来了解其与EMS的相关性。结果表明，MACC1在EMS的异位内膜及在位内膜的表达均明显高于对照组内膜，且异位内膜的表达较在位内膜更高，说明MACC1与EMS存在相关性。MACC1可能通过增强内膜细胞的侵袭、转移、种植的能力参与EMS的发生和发展。

HGF是一种多功能细胞活性因子，须与其受体C-met相结合方能发挥作用，两者结合导致两个酪氨酸残端在羧基端的磷酸化，引起一系列信号转导蛋白的酶促反应［9］。可诱导细胞的运动、促进细胞的分裂和增殖，从而调节肿瘤细胞侵袭性生长，促进肿瘤的转移［10］。正常的HGF/C-met通路可调节和促进组织的损伤和修复，具有积极的作用，而异常激活后则能促进肿瘤的转移。既往研究已证实，HGF/C-met信号通路在多种恶性肿瘤组织中异常表达，并且与肿瘤的进展密切相关［11-12］。EMS虽为良性疾病，但其内膜细胞具有恶性肿瘤细胞的生物学功能，具有较强的侵袭、转移能力，本研究结果显示HGF及其受体C-met蛋白在EMS异位内膜及在位内膜的表达明显高于对照组内膜，且异位内膜中表达高于在位内膜，差异有统计学意义。这说明HGF/C-met信号通路参与EMS发生的可能性，由于子宫内膜异位症中的在位内膜细胞较正常内膜细胞更活跃，在HGF/C-met信号通路的参与及作用下，在位内膜细胞获得更强的增殖、侵袭能力，从而促进在位内膜细胞向盆腔及其他组织种植及转移，形成子宫内膜异位病灶而发病。由于MACC1、HGF/C-met蛋白在异位内膜表达较在位内膜更高，说明异位内膜细胞在发生转移游走后获得了更强的增殖及侵袭能力，使子宫内膜异位症疾病呈现进行性加重的临床表现。另一方面，笔者通过相关性分析发现，在子宫内膜异位症异位内膜及在位内膜组织中，MACC1与HGF、C-met蛋白的表达均存在正相关关系，证实了MACC1、HGF和C-met可能协同参与EMS的发生及发展。而相关研究已经表明MACC1是HGF/C-met信号通路的一个关键调节因子，且C-met已被证明是MACC1的转录子靶点［13］。因此，MACC1是通过调控HGF/C-met信号通路，从而参与EMS的发生及发展。

EMS的分期方法有多种，但目前国内常采用“修正EMS分期法”（ASRM），对腹腔镜探查手术的患者，根据术中异位病灶的部位、数目、大小、粘连程度等进行评分及分期，因此该分期方法可以较为客观的反映疾病的严重程度及预后。本研究通过分析EMS不同ASRM分期中，MACC1、HGF和C-met蛋白分别在异位内膜及在位内膜的表达情况，了解其与临床预后的关系。结果显示随着EMS分期的升高，MACC1、HGF、C-met蛋白的表达呈现同步升高的趋势，仅在I期与II期之间的表达差异无统计学意义，这说明MACC1及HGF/C-met蛋白的高表达与EMS疾病的分期及预后密切相关。反之，抑制MACC1基因的表达，可能通过负调控HGF/C-met信号通路，从而抑制EMS疾病的发展，这又给笔者下一步的研究带来新的思路。

综上所述，MACC1、HGF和C-met可能协同参与EMS的发生及发展，且与疾病的临床预后密切相关。MACC1可能通过调控HGF/C-met信号通路参与EMS的发病。但是，由于研究对象及研究条件的局限性，笔者需要通过扩大样本量及更深入的分子学水平研究来证实这种推测的可能性，将来是否可以通过抑制MACC1的表达来抑制EMS的疾病的发展还需要进一步的研究来推进。