孕晚期B族链球菌携带筛查检测策略

孔银波 邓颖颖 林丽娟 方艳平 黄莉 许心怡 刘天才

1南方医科大学检验与生物技术学院抗体工程研究所（广州510515）；2南方医科大学珠江医院检验医学部（广州510515）

B族链球菌（group Bstreptococcus，GBS）属于条件致病菌，可正常寄居于人体阴道和直肠［1］。由于GBS定植率受种族、年龄、区域等多种因素的影响，不同地区报道的孕妇 GBS带菌率有差异［2，3］。20世纪70年代，GBS被证实为围产期母婴感染的主要致病菌［4］，近年来的研究［5］表明GBS是我国新生儿早发型感染的重要病原菌之一，已引起围产医学界的高度重视。为降低围产期母婴感染的风险，2011年中华医学会妇产科学分会产科学组《孕前和孕期保健指南》将孕晚期35～37周孕妇GBS筛查作为产前检查的备查项目［6］。目前GBS的筛查策略有培养法、PCR法、抗原检测法等［7］。培养法可选用血琼脂、显色培养基、Todd-Hewitt肉汤培养基，PCR法也有多种商用试剂可供选择。目前国内外关于孕晚期B族链球菌携带筛查方法的研究主要是关于各检测方法的灵敏度、特异性的比较，然而合适的筛查策略需要考虑多种因素，目前国内外尚缺乏B族链球菌筛查策略的多维度研究，因此本研究将从筛查的灵敏度及特异性、检测周转时间（turn-around time，TAT）、检测费用等多个维度评价几种筛查策略的应用效果。

1 材料与方法

1.1 样本来源收集南方医科大学珠江医院2017年5月至2018年4月产科门诊孕晚期35～37周孕妇的阴道拭子标本共200例。其中60例为2017年5月至2018年2月用本室自建PCR法检测GBS-DNA阳性并经测序验证的冻存标本，140例为2018年3月至2018年4月新鲜采集的标本。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器5%羊血琼脂平皿及GBS显色培养基购于生物梅里埃公司，细菌鉴定和药敏试验分别采用生物梅里埃VITEK MS MALDI-TOF和VITEK COMPACT2。PCR试剂①购于广东凯普生物科技公司，试剂②购于泰普生物科学有限公司，PCR检测采用美国ABI 7500核酸扩增仪。

1.2.2 检测方法血琼脂培养将新鲜采集的阴道拭子接种在血琼脂平皿上，置于5%CO2培养箱35℃培养18～24 h后，挑取灰白色、表面光滑、有乳光、圆形、多呈β溶血的可疑菌落进行涂片染色镜检、用血琼脂平皿进行分纯培养。分纯后用VITEK MS MALDI-TOF进行鉴定，用VITEK COMPACT2进行药敏试验。显色培养基培养将新鲜采集的阴道拭子接种在GBS显色培养基上，置于5%CO2培养箱35℃培养18～24 h后，挑取淡红至深红色的可疑菌落进行涂片染色镜检、用血琼脂平皿进行分纯培养。分纯后用VITEK MS MALDI-TOF进行鉴定，用VITEK COMPACT2进行药敏试验。PCR法核酸提取及扩增操作分别参照两种PCR试剂的说明书进行，两种试剂盒检测结果不一致的样本将PCR扩增产物进行测序验证。

TAT统计：用实验室信息系统软件统计各筛查方法的TAT。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计数资料采用频数和率表示，计数资料的分析用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四种筛查方法比较140例新鲜采集的标本同时用两种培养法及两种PCR法筛查GBS，血琼脂培养法检出阳性10例，显色培养法检出阳性11例，PCR法①检出阳性12例，PCR法②检出阳性11例，用卡方检验对检测阳性率进行两两比较，四种筛查方法的阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。有8例标本四种筛查方法结果不一致，进行测序验证。以测序和培养结果为金标准，对四种筛查方法进行比较，结果见表1。四种筛查方法的特异度均为100%。PCR法①的灵敏度高于血琼脂培养法和显色培养法，PCR法②的灵敏度与显色培养法相当。

表1 四种筛查方法比较（n=140）Tab.1 The comparison of four methods例

2.2 两种PCR法检测效果比较为进一步比较两种PCR法的检测效果，分别用两种方法检测60例冻存的阳性标本（本室自建PCR法检出［8］）。结果见表2，卡方检验结果表明，两种PCR法的检测效果差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两种PCR法检测效果比较（n=200）Tab.2 The comparison of two PCR methods例

2.3 培养法及PCR法的TAT、检测费用比较血琼脂培养法和显色培养基培养法检测步骤和收费标准相同。培养法及PCR法的TAT和检测费用比较结果见表3。

表3 培养法和PCR法的TAT及检测费用比较Tab.3 The comparison of test costs and TAT between PCR and culture method x±s

表3 培养法和PCR法的TAT及检测费用比较Tab.3 The comparison of test costs and TAT between PCR and culture method x±s

方法培养法（鉴定）培养法（鉴定+药敏）PCR法TAT（h）48.1±11.2 71.9±11.7 9.9±6.1检测费用（元）73.5 147 73.6

2.4 GBS药敏结果分析140例新鲜采集的标本中有11例GBS培养阳性。这11株GBS的药敏情况为：青霉素耐药0株，克林霉素耐药10株，万古霉素耐药0株。用 WHONET5.6软件分析本院2008-2017年分离的421株GBS的药敏情况，未发现青霉素及万古霉素耐药菌株，克林霉素耐药率为35.7%。

3 讨论

研究证实，对孕晚期35～37周的孕妇进行GBS筛查，并对阳性患者采取预防和治疗措施，可降低围产期GBS感染风险［9］。GBS预防和治疗首选的抗生素为青霉素，对有青霉素过敏史的孕妇，可选用大环内酯类药物或万古霉素进行治疗［10］。本研究140例新鲜采集的标本有11例GBS培养阳性，药敏结果对青霉素全部敏感，有10例对克林霉素耐药。用WHONET5.6软件分析本院2008～2017年分离的421株GBS的药敏结果，未发现青霉素耐药菌株，克林霉素耐药率较高。对有青霉素过敏史的孕妇，需根据药敏试验的结果选择抗生素治疗方案，不能仅凭经验用药。

近年来，有学者的研究表明PCR法鉴定的检测阳性率高于培养法鉴定［11-12］。由于本研究的样本例数较少，使用的检测试剂与已报道的文献有所不同，本研究中PCR法鉴定的阳性率略高于培养法鉴定，但这种差异无统计学意义。各厂家的PCR试剂灵敏度略有差异，临床实验室在使用这些试剂盒前需对其进行性能验证，检测性能满足临床要求时方能投入使用。在实际工作中，血琼脂培养法对工作人员的鉴别能力要求更高，由于孕妇生殖道中存在多种细菌，在血琼脂培养基上，很多其它细菌生长快速，使GBS的生长受到抑制或菌落被覆盖而容易导致漏检。显色培养基能够有效抑制杂菌生长，而GBS生长不受影响，显色结果容易观察，因此显色培养基培养法是最简单、对实验室条件及工作人员技术要求最低的方法，基层实验室也能完成。PCR法检测快速、灵敏，但PCR检测需要专有的PCR实验室，特有的实验设备，普通基层医院较难开展，且无法获得GBS菌株，无法进行药敏试验，由于阴道拭子标本成份复杂，可能存在PCR抑制物而导致假阴性结果，也可能存在非特异性扩增导致假阳性结果。

本研究结果显示血琼脂培养法、显色培养基培养法、PCR法检测GBS的阳性率差别无统计学意义，培养法鉴定和PCR法鉴定GBS的费用相等，PCR法鉴定GBS的TAT时间较培养法短。因此对于已建有PCR实验室的医院，可优先考虑PCR法筛查GBS，其检测灵敏度和特异性能满足临床要求，且不增加检测费用，TAT时间＜10 h，有青霉素过敏史的孕妇，只能选择培养法筛查GBS并做药敏试验，TAT时间更长但可获得准确的用药指导。未建有PCR实验室的医院，首选显色培养法筛查GBS，无青霉素过敏史的孕妇只需做培养法鉴定而不需要做药敏试验，有青霉素过敏史的孕妇则加做药敏试验。