Gene Xpert-MTB/RIF检测法在结核病诊断中的意义

虞忻 宋华峰 冯彦军 叶志坚

苏州大学附属传染病医院，苏州市传染病医院，苏州市第五人民医院（江苏苏州215000）

结核病是由结核分枝杆菌（M.tuberculosis，MTB）感染所引起的慢性传染性疾病，是全球公共卫生面临的巨大威胁［1］。WHO统计结果显示，全球MTB感染人数960万，其中150万人最终死于结核病。根据WHO的2016年全球结核病年度报显示［2］，我国新发结核病例数位居全球第3位，也是耐多药结核病（MDR-TB）及广泛耐药结核病（XDR-TB）中，全球最高负担国家之一。同时我国也是在PTB、TB合并AIDS及MDR-TB三种疾病的14个高负担国家之一［3］。结核病很有可能因耐多药甚至广泛耐药成为不治之症，早发现、早诊治成为有效控制结核病的关键。

目前肺结核的诊断主要依靠痰涂片抗酸染色及痰结核培养，痰涂片抗酸染色法阳性率低、敏感性差［4］，且有30%～60%的PTB患者无法根据细菌学确诊［5］，而痰结核分枝杆菌培养所需周期长，所以上述方法不能满足早期诊断的需要甚至可能延误诊疗，导致结核病播散，阻碍结核病的控制。随着分子生物学发展，WHO重点推荐一种新型分子检测方法GeneXpert-MTB/利福平（RIF）（简称Xpert）。Xpert检测方法是一种以半巢式实时定量荧光PCR为基础，以rpoB基因为靶基因，自动提取DNA并扩增rpoB基因中的192 bp片段，并检测MTB及其对RIF是否耐药。由于Gene Xpert-MTB/RIF检测法生物安全性好，敏感度高，及检测时间短，已逐步推广并应用于临床［6-7］。本研究通过对比此技术与传统痰检方法，探讨其在临床诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 标本来源收集苏州市第五人民医院2017年8月至2017年12月收治住院的肺结核患者209例，年龄13～81岁，其中男130例，女79例，平均年龄47.68岁。

1.2 试剂及仪器BACTEC MGIT 960分枝杆菌分析系统、MGIL培养管；Xpert MTB/RIF kit；核酸快速提取仪Extractor 36；抗酸染色试剂、分枝杆菌药敏罗氏培养管等。

1.3 研究方法

1.3.1 痰涂片检查根据抗酸染色镜检结果进行报告，操作过程是按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》的要求进行。

1.3.2 痰培养（1）通过连续测定荧光强度，来测定分枝杆菌的生长情况。（2）在1～2 mL痰液加入50 mL离心管中，加入4%NaOH震荡并混匀，静置并离心后去上清，留沉淀。（3）在培养管中加入杂菌抑制剂（PANTA）和营养添加剂（OADC）混合添加剂0.8 mL。（4）抽取0.5 mL样本注入MGIT培养管中并将培养管放入BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养系统中培养。

1.3.3 结核分枝杆菌改良罗氏及比例法药敏实验（1）分枝杆菌药敏罗氏培养管中设定异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素浓度。（2）制备及稀释菌液。（3）用接种环沾取1满环约为0.01 mL体积的不同稀释倍数菌悬液，用划线法均匀涂布于各培养基表面。（4）37℃培养，至4周报告结果。

1.3.4 XpertMTB/RIF核酸扩增检测 （1）前处理管中放入1 mL痰液标本，并加入液化液。（2）涡旋振荡15～30 s后静置15 min，取2 mL处理后样品缓慢加入反应盒。（3）将反应盒放入检测模块中并自动化检测出结果。

1.3.5 质量控制本实验操作人员均参加并通过中国疾病预防控制中心组织的结核病实验室药敏测试及全国结核病分子诊断技术能力验证等培训及考试。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0进行统计学进行数据分析，进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XpertMTB/RIF对痰结核分枝杆菌检测结果分析209例肺结核患者中，痰涂片阳性49例（23.4%），痰涂片弱阳性5例（2.4%），痰涂片阴性155例（74.2%）；痰培养阳性87例（41.6%），痰培养阴性122例（58.4%）；Xpert MTB/RIF检测阳性86例（41.1%），Xpert MTB/RIF检测弱阳性9例（4.3%），阴性114例（54.6%）。Xpert MTB/RIF检测阳性率明显高于痰涂片，差异有统计学意义（P＜0.05）；痰结核培养阳性率也明显高于痰涂片抗酸染色找抗酸杆菌阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）；而Xpert MTB/RIF检测阳性率与痰培养阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 202例痰标本的3种检测方法结果比较Tab.1 comparison of the results of three methods for the detection of 202 sputum specimens例（%）

以痰结核培养为金标准，Xpert MTB/RIF检测痰涂片抗酸染色阳性患者的MTB敏感度为95.0%、特异度为44.4%；检测痰涂片阴性患者的结核分枝杆菌敏感度为58.1%、特异度为85.8%；全部患者的敏感度为75.9%，特异度为82.8%（表2）。

2.2 Xpert MTB/RIF和传统比例法检测利福平耐药的比较以传统比例法药敏试验为金标准，Xpert MTB/RIF检测涂阳肺结核患者的利福平耐药敏感度为50.0%，考虑可能与样本量少有关，特异度为100.0%；检测痰涂片阴性患者利福平耐药敏感度为70.0%，特异度为100%；全部患者Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的敏感度为66.7%，特异度为100.0%（表3）。在同时痰培养阳性、Xpert MTB/RIF检测也阳性患者中，对Xpert MTB/RIF及传统比例法检测利福平耐药做Kappa检验，结果一致性好（Kappa=0.926）。

3 讨论

我国是全球结核病疫情最为严重的国家之一，结核病尤其是重症结核、MDR-TB、XDR-TB的早期诊治值得尤为关注［8］。目前，新型分子诊断技术在全球广泛开展，Xpert MTB/RIF以其简便、快捷、灵敏度高的特点收到高度关注。Xpert MTB/RIF检测方法是同时采用6种分子信标及检测6种分子探针，选择性覆盖rpoB基因的81 bp核心区，由此检测MTB及是否对RIF耐药；内对照采用另1个球芽孢杆菌特异探针，以判断DNA扩增效率。几乎所有的RIF敏感菌株在该区域具有相同的核酸序列，RIF耐药菌株中95%以上均由rpoB基因变异所导致，因此rpoB基因能作为利福平相关基因，并具备测定RIF耐药菌株的能力［9-10］。将样品准备、定量PCR扩增和荧光检测集一身的Xpert MTB/RIF检测技术，作为世界上唯一一体化全自动实时定量PCR体外诊断技术，仅2 h便可以检测出MTB及其RIF耐药情况［11-12］。该检测系统操作快捷简便，实验中基本不产生气溶胶，减少了样本中MTB生物危害的风险［13］，而且试剂盒需独立存放，减少了DNA的污染可能，这些特点均超越了传统检测方法，并能早期诊断RR-TB及MDR-TB，使全球MDR-TB检出率提高3～8倍［14］，受到WHO的高度推崇。

表2 Xpert MTB/RIF检测与痰培养检测结果的比较Tab.2 comparison of the results of Xpert MTB/RIF and sputum culture 例（%）

表3 Xpert MTB/RIF和传统药敏检测利福平耐药的比较Tab.3 comparison of rifampicin resistance by Xpert MTB/RIF and traditional drug sensitivit 例（%）

本研究209例肺结核患者中，Xpert MTB/RIF检测的阳性率为41.1%，明显高于痰涂片，而与传统痰培养相比，差异无统计学意义，这与国外相关研究结果一致。以痰培养为金标准，Xpert检测的敏感度高达75.9%、特异度高达82.8%，与现有的国际上Xpert MTB/RIF检测技术的研究结果相似［15］。检测总特异度高，说明Xpert对结核分枝杆菌检出假阳性较低、准确率很高［16-17］。其中在痰涂片阴性患者中，Xpert MTB/RIF检测MTB敏感度较总敏感度偏低，可能和负荷菌量偏低有关，但也高达58.1%，说明Xpert能显著提高菌阴患者的结核检出率；检测痰涂片阳性患者中，获得的特异度为44.4%，这4例假阳性患者抗结核治疗均有效，所以考虑虽然当时不能符合临床确诊标准，但考虑确实存在结核感染可临床诊断肺结核。近几年有报道表明，Xpert MTB/RIF检测技术在运用于肠结核等肺外结核患者上，敏感度也远远高于涂片抗酸染色法，与快速结核分枝杆菌培养法基本相同，特异度高［18］。Xpert MTB/RIF检测MTB的高敏感度极大提高肺结核检出率，尤其对于痰涂片阴性患者肺结核早期诊断与治疗提供有力证据。

以传统比例法药敏为金标准，Xpert MTB/RIF检测RIF耐药敏感度为66.7%，特异度为100.0%，和传统比例法药敏试验行Kappa检验（K=0.926），说明Xpert MTB/RIF及传统比例法对利福平耐药的检测有极好的一致性，与文献报道基本一致［19］。在临床工作中，单独对RIF耐药较少，绝大多数均为在耐RIF同时也耐INH，即为耐多药结核病（MDR-TB）。GUENAUI等［20］报道大约90% 对RIF耐药的MTB会同时对INH产生耐药，所以检测是否对RIF耐药，也可在一定程度上作为检测是否为MDR-TB一种检测手段，很大程度上缩短了诊断MDR-TB时间，另一方面也控制了MDR-TB的传播。Xpert MTB/RIF检测方法为数百万结核病甚至MDR-TB、XDR-TB患者带来了新希望，被WHO遏制结核病司司长Maoio Rarig lione博士评价为全球结核病诊治手段的一个及其重要的里程碑。

综上所述，Xpert检测与传统方法相比，敏感度高、特异度高，操作方法便捷，同时能快捷检测出RIF耐药，很大程度上预测了MDR-TB，具有重要意义；同时可为临床诊断，选择和调整耐药结核的治疗方案提供参考，有广阔的应用前景。但由于临床上也会遇到Xpert结果与传统痰培养及药敏结果不一致现象，如何正确分析结果并相应的指导临床诊断和治疗，仍需要不断的探索和研究。