结直肠癌中KRAS、NRAS基因突变与临床病理特征的关系

潘理会 李育庄 李春辉

(承德医学院 1血流变学与分子细胞学研究室，河北 承德 0670000；2附属医院病理科)

研究报道结直肠癌(CRC)的发生、发展与表皮生长因子受体(EGFR)介导的信号传导通路EGFR/大鼠肉瘤(RAS)/鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)的调控密切相关〔1〕，近年一些靶向EGFR的单抗药物已成功应用于CRC的临床治疗，取得良好疗效，但抗EGFR单抗药物的有效性受其下游RAS基因〔包括大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、大鼠肉瘤病毒转化基因(NRAS)〕类型的影响，对RAS野生型携带者疗效显著，对RAS突变型患者疗效不佳。目前检测KRAS和NRAS基因突变状态已成为众多专家学者研究肿瘤靶基因治疗的热点课题，本文采用实时荧光定量PCR检测KRAS、NRAS基因在CRC组织中的表达情况，并结合临床病理参数探讨二者在CRC发生、发展中的作用机制。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2012年12月至2015年5月间承德医学院附属医院行手术切除的CRC蜡块标本238例。所选标本均有完整的临床病历及病理资料，且术前均未接受任何化疗及抗肿瘤药物治疗。

1.2DNA提取 将CRC石蜡包埋组织连续切片4 μm厚1～2张，苏木精-伊红(HE)染色，显镜下观察形态，标记肿瘤细胞比例达70%以上的标本。将做好标记的标本连续切片8～10 μm厚5～6张，常规脱蜡、水化处理，刮取肿瘤组织于EP管内，按照试剂盒说明书步骤提取DNA，应用紫外分光光度计测定提取DNA的质量和浓度，A260/A280在1.7～2.1之间为符合标准。

1.3实时荧光定量PCR扩增 采用PCRTaqMan探针技术检测标本中KRAS、NRAS基因的突变情况，严格按照检测试剂盒说明书进行操作。反应体系包括模板50 ng、正反向引物各25 pmol、Master Mix及TaqMan标记探针，总反应体系各为50 μl。反应条件分3步：第1步：42℃ 5 min，95℃ 5 min，1个循环；第2步：95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15个循环；第3步：93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31个循环，第3阶段60℃收集信号，进行实时荧光定量PCR。每次实验均设定突变的阴、阳性及空白对照孔。

1.4结果判读 以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值，没出现扩增曲线或Ct≥28.0的标本为阴性标本；出现扩增曲线且Ct≤26.0的标本为阳性标本；26.0

1.5试剂与仪器 石蜡组织DNA提取试剂盒及人KRAS、NRAS基因突变检测试剂盒均购自厦门艾德生物医药科技有限公司；实时荧光定量PCR仪购自杭州赫贝科技有限公司。

1.6统计学方法 采用SPSS11.5软件进行χ2检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1KRAS基因突变情况及与临床病理特征的关系 86例(36.1%)KRAS基因突变，随着淋巴结远处转移和Duke分期的增高KRAS突变率明显增加(P<0.05)，在其他临床病理特征的组间差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2NRAS基因突变情况及与临床病理特征的关系 11例(4.6%)NRAS基因突变。NRAS突变率在各临床病理特征的组间差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3CRC组织中KRAS与NRA基因突变的相关性 未检测到KRAS与NRAS同时突变者，表明二者突变相互排斥，相关分析显示，KRAS与NRAS 突变没有明显相关性 (r=0.782，P=0.058)。

表1 CRC组织中KRAS基因突变与临床病理特征的关系〔n(%)〕

表2 CRC组织中NRAS基因突变与临床病理特征的关系

3 讨 论

EGFR是一种酪氨酸激酶受体，与配体结合后激活刺激其介导的下游信号传导通路膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传递途径(RAS/RAF/MAPK)发生级联反应，导致细胞异常增殖、转移，发生癌变〔1〕。抗EGFR单抗可通过拮抗其与配体的结合，阻止其活化，进而阻断其下游信号通路的传导，从而发挥抗瘤作用。KRAS与NRAS基因是EGFR通路下游调控因子RAS家族的重要成员，二者中任何一种发生突变都可不通过EGFR活化刺激而直接激活EGFR通路引发癌变。国外文献报道在CRC中KRAS突变率为30%～55%，主要发生在2外显子12和13密码子上；NRAS突变率为1%～6%，主要发生在3外显子61密码子上〔2,3〕。国内研究报道CRC中KRAS突变率为43.8%,NRAS突变率较低为1.9%〔4〕。也有报道CRC中KRAS突变率为42.57%，NRAS突变率为3.96%〔5〕。本研究与国内外报道的基本相符，同时本研究数据显示KRAS突变率明显高于NRAS，KRAS突变在CRC中是常见的生物学事件，可能是CRC发病的主要机制之一，而NRAS可能不是主要机制。KRAS的突变状态可作为临床选用抗 EGFR单抗药物的重要参考指标，而NRAS突变状态的预测价值还在探讨中。研究表明，对CRC患者行单一检测KRAS基因是不够的，还要联合检测NRAS基因，只有联合检测KRAS、NRAS基因的CRC的患者才能建议使用EGFR靶向药物治疗〔6〕，所以，肿瘤组织中NRAS突变率虽然偏低，其突变状态的检测是不可忽视的，联合检测KRAS、NRAS基因突变状况，对筛选出适应抗EGFR靶向药物治疗的患者有重要的指导价值。

目前，关于KRAS和NRAS突变状态与CRC中临床病理参数的关系报道无统一定论。有文献报道，CRC中KRAS突变在有淋巴结转移和TNM分期增加的患者中明显增高〔7〕；CRC中KRAS突变更常见于女性和近端结肠〔8〕；CRC中NRAS突变在远端结直肠癌突变率较高〔9〕；还有研究报道CRC患者KRAS/NRAS突变与年龄相关，≥65岁的老年患者突变率较高，而与性别、原发部位、组织学类型、分化程度、分期、区域淋巴结转移、术后复发转移均无关〔10,11〕。吴新新等〔12〕对147例CRC患者的KRAS和NRAS基因突变情况进行检测，发现KRAS突变的发生更倾向于淋巴结转移及Duke分期C期患者，与年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、远处转移、癌结节及美国癌症联合会(AJCC)分期等均无关；NRAS突变与上述所有病理特征均无相关关系。代云等〔13〕对265例CRC患者的KRAS和NRAS基因突变情况进行检测，发现二者突变与年龄相关，高龄患者突变率较高，而与性别、原发部位、组织学类型、分化程度、TNM分期、区域淋巴结转移、远处转移、术后复发转移等临床病理特征均无关。本研究表明KRAS参与了CRC的侵袭、转移，预示患者预后不良；KRAS突变对高危转移患者的早期筛选和预后评估有重要参考价值，也为肿瘤的侵袭、复发机制研究提供了新的方向。上述结论各家研究，差异很大，造成这些差异的原因，可能与各家研究的样本量、检测方法及判读标准不同等因素有关，有待于进一步研究探讨。上述研究结果表明KRAS和NRAS虽同为一个家族成员，同为EGFR信号通路下游重要的效应因子，但在肿瘤发生、发展过程中所起的调控作用不尽相同。近年来，国内外对CRC中EGFR信号通路上KRAS/NRAS突变状态与临床病理参数关系的研究刚刚兴起，许多认识还不够成熟，尤其对NRAS的检测较少且检出率偏低，提示临床CRC患者抗EGFR药物治疗时，应多基因联合检测来指导靶向药物方案的制定。明确KRAS/NRAS与CRC病理参数的相关性，有助于阐明CRC发病机制，有助于CRC的靶基因治疗。对二者突变状态的检测还应扩大检测规模，采取多种研究手段，综合论证分析。目前，关于肿瘤中KRAS和NRAS突变之间相关性的研究国内外少见报道，有资料显示，CRC中KRAS和NRAS之间基本不存在交叉突变〔14〕，二者突变相互排斥〔15〕。本研究与上述研究结果相一致，经相关分析显示，KRAS和NRAS之间突变没有关联，提示二者可能是彼此独立的影响着CRC的进程，具体机制还需进一步研究。