猕猴桃根多糖调控Wnt信号通路抑制结肠癌增殖促进其凋亡

罗绪 罗丽丹 尚献会

(1遵义医学院附属医院中医科，贵州 遵义 563000；2遵义医药高等专科学校；3遵义医学院附属医院小儿外科)

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，近些年发病率呈现上升趋势〔1〕。肿瘤细胞增殖和凋亡不平衡是其发生发展的重要因素。有效诱导肿瘤凋亡成为肿瘤治疗的一个新方法。猕猴桃根具有抗癌、健胃、活血消肿等多种功效，其提取物对肿瘤具有抑制作用。研究显示，猕猴桃根提取物可通过抑制信号传导及转录激活因子(STAT)3降低肝癌进展〔2〕；猕猴桃根多糖(ACPS)可抑制胃癌细胞生长〔3〕，这提示猕猴桃根在肿瘤中有重要作用。但ACPS对结肠癌细胞生物学特性的影响还未明确。Wnt信号通路与肿瘤发生发展有密切关系，在包括结肠癌在内的多种肿瘤中过度激活〔4,5〕。研究显示，抑制Wnt信号通路可诱导结肠癌细胞凋亡，抑制增殖〔6〕。ACPS是否可调控Wnt信号通路影响结肠癌细胞生物学特性还未明确。本研究检测ACPS或Wnt信号通路抑制剂XAV-939对HT29细胞活力和凋亡的影响，以期为结肠癌的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 人结肠癌HT29细胞购自中国科学院上海细胞库；β-catenin、cyclinD1、survivin抗体均购自美国CST；XAV-939购自美国Sigma-Aadrich；Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)及流式细胞仪均购自美国BD；细胞计数试剂盒(CCK)8购自上海碧云天；酶标仪购自日本Hitech。

1.2CCK8检测ACPS对HT29细胞活力的影响 将生长至对数期的HT29细胞制备成细胞悬液，并将浓度调整为5×104/ml，接种于96孔板，每孔中加入200 μl的细胞悬液，培养24 h以进行同步化处理，加入终浓度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml的ACPS，每个浓度设置3个复孔，阴性对照组中不加入药物，空白组不加入细胞，均加入100 μl培养液，于培养24、48和72 h加入CCK8溶液，均加入100 μl，孵育2 h，在450 nm处，酶标仪测定各孔吸光度值(A值)。A值可间接反映细胞增殖能力。实验重复3次。

1.3ACPS调控Wnt信号通路对HT29细胞活力的影响 HT29细胞分为四组，即阴性对照组、ACPS组(4.00 mg/ml的ACPS处理细胞)、XAV-939组(10 μmol/L的XAV-939处理细胞)和ACPS+XAV-939组(4.00 mg/ml的ACPS和10 μmol/L的XAV-939处理细胞)。以5×104/ml浓度接种HT29细胞于96孔板，每孔200 μl，培养24 h后按照上述分组处理细胞，于处理后48 h参照1.2方法检测各组细胞A值。实验重复3次。

1.4ACPS调控Wnt信号通路对HT29细胞凋亡的影响 收集按照1.3分组处理48 h的4组细胞，胰酶消化及磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，400 μl的1×结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，加入 5 μl Annexin V-FITC，混合均匀后避光孵育15 min，再加入PI 10 μl，混合均匀后避光孵育5 min，1 h内上机，流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.5Western印迹 收集按照1.3分组处理48 h的4组细胞，加入100 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液提取总蛋白，蛋白定量后，取总蛋白等量(40 μg)，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后电转至硝酸纤维素膜，转好的膜用5%的脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1 000稀释的一抗(β-catenin、cyclinD1、survivin及内参β-actin)，4℃过夜，加入1∶1 000稀释的二抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记〕，室温孵育1 h，洗膜，加入电化学发光(ECL)显色，显影后，以β-actin为内参蛋白，通过凝胶图像处理系统分析目的蛋白相对于β-actin蛋白的光密度值。

1.6统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1ACPS对HT29细胞活力的影响 0.25 mg/ml和0.50 mg/ml的ACPS对HT29细胞活力影响与阴性对照组比较差异无统计学意义(24 h：P>0.05)，而1.00～4.00 mg/ml的ACPS在24～72 h均能降低HT29细胞活力，与阴性对照组比较差异具有统计学意义，且具有浓度依赖性，各浓度均呈现时间依赖性。见表1。

表1 ACPS对HT29细胞活力的影响

与阴性对照组比较：1)P<0.05；与24 h比较：2)P<0.05

2.2ACPS调控Wnt信号通路对HT29细胞活力的影响 ACPS和XAV-939均能抑制HT29细胞活力(0.635±0.047，0.718±0.055)，与阴性对照组(1.262±0.068)比较差异具有统计学意义(P<0.05)，两者联合对细胞活力抑制作用更明显(0.431±0.036)，且与ACPS和XAV-939组细胞活力比较差异均具有统计学意义(F=135.422，P=0.000)。

2.3ACPS调控Wnt信号通路对HT29细胞凋亡的影响 ACPS和XAV-939均能诱导HT29细胞凋亡(13.44%±0.39%、10.12%±0.31%)，与阴性对照组(2.31%±0.16%)比较差异具有统计学意义(P<0.05)，两者联合对细胞凋亡的诱导作用更明显(18.85%±0.54%)，且与ACPS和XAV-939组细胞凋亡率比较差异均具有统计学意义(F=1 016.887，P=0.000)。见图1。

图1 ACPS调控Wnt信号通路对HT29细胞活力的影响

2.4ACPS对Wnt信号通路相关蛋白表达的影响 ACPS和XAV-939均能抑制β-catenin、cyclinD1和survivin蛋白表达，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，两者联合对β-catenin、cyclinD1和survivin蛋白表达抑制作用更明显，且与ACPS和XAV-939组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。

图2 ACPS对Wnt信号通路相关蛋白表达的影响

组别β-catenincyclinD1survivin阴性对照组0.741±0.0580.321±0.0350.198±0.023ACPS组0.256±0.0281)2)0.156±0.0181)2)0.085±0.0101)2)XAV-939组0.339±0.0341)2)0.204±0.0211)2)0.119±0.0141)2)ACPS+XAV-939组0.134±0.0150.097±0.0110.031±0.006F值149.95051.31468.194P值0.0000.0000.000

3 讨 论

我国中药资源比较丰富，中药中有效活性成分在结肠癌治疗中发挥重要作用。如黄芪多糖、灵芝多糖均可抑制结肠癌细胞增殖，诱导凋亡〔7,8〕。猕猴桃根为猕猴桃科植物猕猴桃的根或根皮，目前已证实从根茎中提取的多糖复合物或多糖、三萜类化合物等具有多种生物活性，且在一些地区用于抗癌的佐剂。如猕猴桃根三萜类化合物及ACPS均可抑制胃癌增殖和促进凋亡〔9〕。本研究结果与Song等〔3〕研究ACPS对胃癌细胞增殖影响的趋势是一致的。ACPS对结肠癌发生发展的影响可能是通过抑制癌细胞增殖和诱导凋亡。

Wnt信号通路异常激活与结直肠癌、肺癌等多种肿瘤发生发展密切相关，分为经典Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路，Wnt/β-catenin为经典的Wnt信号通路。当Wnt信号受到刺激时，其配体和受体结合，胞质内β-catenin蛋白积累，进入细胞核，并结合细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)激活cyclinD1、c-myc等下游靶基因，进而影响肿瘤生物学特性〔10,11〕。有研究显示，抑制Wnt/β-catenin信号通路可降低包括结肠癌在内的多种肿瘤发生发展〔12〕。XAV-939为Wnt/β-catenin信号通路抑制剂，可抑制多种肿瘤生长〔13,14〕。cyclinD1为调控细胞周期的因子，可对细胞增殖及周期完成起促进作用，在结肠癌中表达升高，其表达升高与结肠癌预后、临床分期等密切相关〔15〕。Survivin也是Wnt信号通路的下游靶基因，为凋亡抑制基因，结肠癌中表达升高，抑制其表达可诱导结肠癌细胞凋亡〔16〕。有研究发现，XAV-939可通过调控cyclinD1和survivin表达抑制结肠癌发展〔17,18〕。综上，ACPS可能通过下调Wnt信号抑制结肠癌增殖和诱导凋亡。