AT2R通过NF-κB信号对人膝骨关节炎滑膜组织成纤维样细胞中IL-6、IL-1β表达的影响

宋鹏 荆凯 魏鹏飞 孙永强 谭斌

(1河南省中医院烧伤显微修复科，河南 郑州 450002；2河南省骨科医院骨科；3中国人民解放军第113医院显微手足外科)

骨关节炎(OA)是一种关节软骨慢性退行性病变，以软骨变性、骨质增生、滑膜炎为主要病理特征〔1〕。关节炎主要由淋巴细胞、巨噬细胞和滑膜衬里成纤维细胞驱动，也被称为成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)或B型滑膜细胞〔2〕。过度增生的FLS能够通过局部产生促炎性细胞因子如白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α及小分子炎症介质来促进滑膜炎的初始阶段〔2,3〕，因此，控制FLS异常增殖是治疗OA的重要途径〔4〕。血管紧张素Ⅱ具有两种主要的G蛋白耦联受体亚型，即血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)和血管紧张素Ⅱ 2型受体(AT2R)〔5〕。AT1R在培养的类风湿关节炎(RA)-FLS和关节炎啮齿动物模型的增生性滑膜中高度表达，其已经被提出作为可能的治疗靶点〔6,7〕，但对于AT2R的功能却知之甚少。本研究将检测AT2R在膝OA滑膜组织中表达；原代分离培养正常人FLS(H-FLS)和膝OA患者FLS(OA-FLS)，观察炎症因子对细胞中AT2R表达影响；干扰与激活OA-FLS中AT2R表达检测其对IL-6 和IL-1β表达、核因子(NF)-κB活性及细胞增殖影响，以期阐明AT2R在OA发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1临床标本收集 收集河南省中医院2014年2月至2015年12月经手术治疗膝关节OA患者54例，男24例，女30例，年龄48～65〔平均(55.4±4.1)〕岁，OA诊断均符合美国风湿病学会制订的膝关节OA诊断标准〔4〕，且OA患者均没有接受任何缓解疾病的药物治疗。另取36例为无OA病史的创伤性截肢患者作为对照组，男22例，女14例；年龄45～58〔平均(51.6±5.7)〕岁。受试者均签署书面知情同意书，研究方案获得医院伦理委员会批准同意。

1.2FLS细胞分离培养与鉴定 取健康和膝关节OA滑膜组织，用无菌磷酸盐生理盐水磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，眼科剪剪去多余脂肪、软骨等组织并剪成糊状，加入10倍体积的Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)，于37℃、5%CO2细胞培养箱消化2 h，200目不锈钢筛网过滤，1 500 r/min离心5 min，将收集到的细胞接种至含有15%胎牛血清(Gibco公司)、2 mmol/L谷氨酰胺(Gibco公司)和1%青霉素-链霉素(Gibco公司)的RPMI1640培养基(Gibco公司)中培养，待细胞长至约80%融合度时，进行消化传代培养，取第3～4代对数生长期细胞用于实验〔4〕，培养3～4代H-FLS和OA-FLS细胞呈梭形，细胞核呈卵圆形位于细胞中央，为了进一步鉴定分离得到的原代滑膜成纤维细胞，分别用CD14、CD90和Vimentin抗体对培养的细胞进行Western印迹检测，结果如图1所示，H-FLS和OA-FLS细胞中CD90、Vimentin蛋白表达阳性，CD14蛋白表达阴性，说明该细胞来源于中胚层，并具有成纤维细胞样特点。分别记为H-FLS和OA-FLS细胞。

1.3Western印迹法 取适量3～4代H-FLS和OA-FLS细胞，用RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司)裂解30 min，取上清液至新的EP管中于4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度，置于-80℃保存。将H-FLS和OA-FLS细胞分别用20 ng/ml的TNF-α(PeproTech公司)、10 ng/ml的IL-1β(PeproTech公司)及两者联合处理细胞24 h〔8〕，提取蛋白进行保存，并将各组依次记为TNF-α组、IL-1β组、TNF-α+IL-1β组，以不做任何处理细胞记为空白组。取20 μg蛋白样品配置成上样缓冲液，加入十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行电泳分离，110 V恒压转膜1 h，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用AT2R(Abcam公司)、GAPDH(碧云天生物技术有限公司)一抗孵育过夜，后用相应二抗室温孵育2 h，采用电化学发光(ECL)液进行曝光显影，Image J软件分析各条带蛋白相对表达量。

1.4沉默细胞中AT2R表达 取对数生长期OA-FLS细胞接种于6孔板中，待细胞过夜长至60%融合度时，根据Lipofectamine®2000(ThermoFisher scientific)转染试剂说明书将10 nmol/L的AT2R siRNA(siAT2R，Santa Cruz Biotechnology)或阴性对照(NC，Santa Cruz Biotechnology)转染至细胞中，转染48 h后，按照1.3中步骤进行Western印迹检测AT2R蛋白表达。

1.5qPCR检测IL-6、IL-1β表达 取1.2中分离得到的OA-FLS细胞，转染NC、siAT2R或用10 μmol/L的AT2R激动剂CGP42112A(Sigma公司)处理24 h，依次记为NC组、siAT2R组和AT2R激动剂组，以不做任何处理细胞作为空白组，使用TRIzol分离提取各组总RNA，Nanodrop 2000测定各组RNA浓度。采用Script Ⅱ逆转录酶试剂盒进行逆转录，2×SYBR绿色荧光染料试剂盒上机检测各组细胞IL-6、IL-1β表达，以18S为内参，按照2-ΔΔCt法计算各组细胞中IL-6、IL-1β mRNA相对表达水平。IL-6引物：正义链：5′-AAAGAGGCACTGGCAGAAAA-3′，反义链：5′-TTTCACCAGGCAAGTCTCCT-3′；IL-1β引物：正义链：5′-TTCTTCGACACATGGGATAACG-3′,反义链：5′-TCCCGGAGCGTGCAGTTCA-3；18S引物：正义链：5′-CCGCAGCTAGGAATAATGGAATA-3′，反义链：5′-TCTAGCGGCGCAATACGAAT-3′。

图1 Western印迹法检测H-FLS和OA-FLS细胞中蛋白表达

1.6荧光素酶报告基因实验 人含有NF-κB 结合位点的IL-6启动子荧光素酶报告基因载体pIL-6-promoter-luc，利用点突变试剂盒(Takara公司)将IL-6启动子区NF-κB结合位点突变构建pIL-6-promoter-luc-Mut质粒。取对数生长期OA-FLS细胞、NC细胞、siAT2R细胞接种于12孔板中，待细胞过夜长至60%融合度时，根据Lipofectamine®2000(Thermo Fisher scientific公司)转染试剂说明书将0.25 μg pIL-6-promoter-luc-WT/Mut和0.125 μg phRL-null(Promega公司)共转染入细胞中，6 h后更换新鲜培养基，分别记为对照组、NC组、siAT2R组，以AT2R激动剂CGP42112A(Sigma公司)处理24 h作为AT2R agonist组。根据双重荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)检测各组相对荧光素酶活性。

1.7细胞增殖检测 取2×104个OA-FLS细胞接种至96孔板中培养过夜，后将细胞用无血清培养基洗涤3次，并在含0.2%胎牛血清的RPMI1640中再温育24 h。将FLS在含有TNF-α、CGP42112A培养基中继续培养24 h，记为TNF-α组和AT2R激动剂组，以不做任何处理细胞作为空白组，以转染siAT2R为siAT2R组。使用MTT进行细胞增殖测定，实验进行3次生物学重复。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1对照组与OA组AT2R表达 OA组AT2R蛋白表达量(2.11±0.42)较对照组(1.02±0.31)显著增加(t=3.617，P=0.022)，提示AT2R可能与OA发生有关。见图2。

1、2、3：对照组；4、5、6：OA组图2 对照组与OA组AT2R表达

2.2炎症因子对OA-FLS细胞中AT2R表达及增殖影响 与空白组相比，TNF-α组、IL-1β组及IL-1β+TNF-α组H-FLS细胞及TNF-α组、IL-1β+TNF-α组OA-FLS细胞中AT2R表达均显著增加(P<0.05)，表明膝骨关节炎炎症微环境可导致滑膜组织AT2R表达增加。见图3，表1。

1～4：H-FLS细胞；5～8：OA-FLS细胞；1、5：空白组；2、4：IL-1β组；3、7：TNF-α组；4、8：IL-1β+TNF-α组图3 炎症因子TNF-α、IL-1β对H-FLS和OA-FLS中AT2R表达影响

组别H-FLSOA-FLS空白组0.07±0.010.42±0.03IL-1β组0.13±0.011)0.43±0.03TNF-α组0.28±0.021)0.52±0.041)IL-1β+TNF-α组0.39±0.041)0.75±0.081)F值114.68228.816P值0.0000.000

与空白组相比：1)P<0.05

2.3干扰和激活AT2R对OA-FLS中炎症因子表达影响 siAT2R组AT2R蛋白表达(0.21±0.02)较NC组(0.46±0.04)明显降低(t=9.683，P=0.001)，见图4。与NC组相比，siAT2R组IL-6、IL-1β mRNA表达明显增加(P<0.05)，而AT2R激动剂组IL-6、IL-1β mRNA表达显著降低(P<0.05)，见表2。

2.4AT2R对OA-FLS细胞中NF-κB 信号通路影响 与对照组相比，TNF-α组、siAT2R组NF-κB p65活性显著增加(P<0.05)，AT2R激动剂组NF-κB p65活性明显被抑制(P<0.05)；而将IL-6启动子上NF-κB p65结合位点突变构建的pIL-6-promoter-luc-Mut载体转入细胞后，TNF-α、siAT2R、AT2R激动剂各组荧光素酶活性均无明显变化(P>0.05)。见图5，表3。结果表明，激活AT2R能够抑制NF-κB对炎症因子IL-6诱导作用。

图4 Western印迹法检测OA-FLS细胞中转染siRNA后AT2R蛋白表达

组别IL-6IL-1β空白组1.00±0.031.00±0.02NC组0.98±0.041.02±0.03siAT2R组1.32±0.081)1.35±0.061)AT2R激动剂组0.41±0.041)0.45±0.031)F值163.762287.793P值0.0000.000

与NC组相比：1)P<0.05

图5 NF-κB在IL-6启动子区的结合位点

组别pIL-6-promoter-luc-MutpIL-6-promoter-luc-WT对照组1.00±0.121.57±0.18TNF-α组1.12±0.146.12±1.031)siAT2R组1.03±0.094.03±0.941)AT2R激动剂组0.99±0.110.71±0.081)F值0.77536.380P值0.5400.000

与对照组相比：1)P<0.05

2.5激活AT2R对OA-FLS细胞增殖影响 与空白组相比，在48 h、72 h时TNF-α组、siAT2R组OA-FLS细胞增殖能力显著增强(P<0.05)，而AT2R激动剂组细胞增殖能力被显著抑制(P<0.05)。见表4。

表4 各组OA-FLS细胞增殖能力比较

与空白组相比：1)P<0.05

3 讨 论

OA是常见的关节疾病之一〔9〕，主要表现是关节疼痛和活动不灵活，多发生于老年人群，研究表明，OA与关节局部的炎症反应密切相关〔10〕。AT2R在多种疾病中起重要作用，如心血管疾病、高血压、免疫疾病等。苗莉等〔11〕研究发现，AT2R基因可能抑制血管损伤后骨桥蛋白(OPN)的表达及新生内膜的过度增生。寇学俊等〔12〕研究报道，AT2R基因多态性与老年原发性高血压患者动态血压参数有关。唐兵等〔13〕研究表明，AT2R能够抑制树突细胞成熟诱导的局部免疫炎性反应，推测AT2R可能介导抑制动脉粥样斑块的进展。此外，有研究报道AT2R在大鼠佐剂性关节炎滑膜组织中表达，TNF-α或IL-1β促炎性细胞因子刺激牛软骨细胞中也表达AT2R，而在未刺激的细胞中则无此现象〔14,15〕。有研究也表明AT2R可能介导与AT1R相反的作用，其可能主要发挥抗炎作用〔16～19〕。然而，到目前为止，尚无体外研究AT2R在FLS细胞中的表达和可能功能。本研究发现，与健康患者滑膜组织相比，OA患者滑膜组织中AT2R表达显著增加。值得注意的是，用TNF-α和IL-1β处理不仅能够促进OA-FLS中AT2R的表达，而且还能诱导其在H-FLS中表达。本研究表明，促炎性刺激可以诱导和维持FLS中AT2R的表达，这与先前研究结论相一致，在体内AT2R在健康组织中仅微弱表达，而当组织损伤情况下AT2R表达强烈明显增加〔20〕，提示AT2R与OA进展密切相关。

细胞因子是参与免疫和炎症反应的细胞所分泌的、能调节细胞功能的小分子蛋白和多肽〔21〕，其广泛存在于机体各种组织中，它们从分子水平上对多种疾病的发生发展起较为重要的调节作用〔22,23〕。有研究者发现关节功能的丧失与血清及组织中促炎性细胞因子的高浓度有关〔14〕。Pattacini等〔6〕研究表明，血管紧张素Ⅱ能够通过AT1R依赖的NF-κB通路激活来保护RA-FLS免于凋亡。本研究证实OA-FLS中AT2R表达增加，这进一步促使我们来阐明AT2R在调节这些细胞功能表型的潜在作用。因此，本研究探讨了AT2R功能获得或丧失是否会影响OA-FLS中促炎性细胞因子的基因表达及NF-κB激活，发现在OA-FLS细胞中敲减AT2R明显促进了IL-6、IL-1β表达，相反AT2R激动剂CGP42112A处理后IL-6、IL-1β表达显著被抑制，这与先前在糖尿病危害动脉粥样硬化、早期糖尿病肾炎、内皮炎症及巨噬细胞中研究结论一致，AT2R可能主要发挥抗炎作用〔16～19〕。用AT2R激动剂治疗OA-FLS显著降低NF-κBp65的DNA结合活性，这与Rompe等〔24〕通过激活AT2R能够阻断原代人和小鼠真皮成纤维细胞中NF-κB来降低TNF-α诱导的IL-6水平的研究结论一致。此外，MTT实验发现敲减AT2R明显促进了细胞增殖，而AT2R激动剂则明显抑制了OA-FLS增殖能力。

综上所述，本研究证明AT2R在膝骨关节炎滑膜组织中高表达；促炎因子可刺激FLS中AT2R 显著上调；用选择性激动剂激活AT2R能够抑制OA-FLS中促炎因子IL-6、IL-1β表达，抑制细胞OA-FLS增殖，阐明了一种膝骨关节炎进展的正反馈机制，提示AT2R激动剂可能代表了一种潜在的缓解OA滑膜炎症的新型治疗策略，但是还需要进一步的转化研究。