正交试验优选痔瘘宝洗剂的提取工艺研究※

谢锴标 吴美珠 邱新华* 陈震尧 刘 燕

痔瘘是临床上多发病、常见病，其主要临床表现为疼痛、便血、脱出、局部分泌物增多和排便困难等，中医治疗以坐浴为主[1]。痔瘘宝洗剂是肇庆市中医院肛肠科专家经过多年治疗肛肠疾病总结筛选出的经验方，经剂型改革研制而成，具有消肿、止痛、止血、祛湿功效，用于治疗肛痔炎症、肛裂溃烂出血、肛门湿疹搔痒等疗效显著。痔瘘宝洗剂由大黄、两面针、苦参、地榆、白芷、芒硝六味中药煎煮浓缩而成。方中大黄、两面针活血消肿止痛为君药，苦参清热祛湿止痒、地榆凉血止血收敛生肌为臣药，白芷消肿散结、芒硝清热解毒为佐药。《本草纲目》中记载大黄能“诸火疮”，《本草新编》中 记载大黄“破症结，散坚聚”，《日华子本草》中记载大黄能“切疮疔痈毒”。现代药理学研究表明，大黄具有杀灭病原微生物、抗炎、抗肿瘤作用[2]。其抗菌机制为大黄素可破坏细菌细胞膜通透性，抑制细菌内的蛋白质合成[3]。因此，本试验以大黄素含量和干浸膏得率为评价指标，采用正交试验方法优化提取工艺，以期为该制剂的规模生产提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1260-LC 型液相色谱仪、JA2003N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；RS-FS1401 型多功能粉碎机（合肥荣事达小家电有限公司）；KQ5200DE 型数控超声波清洗仪（东莞市科桥超声波设备有限公司）；FA1004N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；1601 型电陶炉（广东艾诗凯奇智能科技有限公司）；JC101 型电热鼓风干燥箱（南通嘉程仪器有限公司）；420-A 型电热恒温水浴锅（姜堰市新康医疗器械有限公司）；ZF1-I 型多功能紫外分析仪（上海和勤分析仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

大黄素（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201512）；芒硝（广州至信中药饮片有限公司，批号：180701）；大黄（肇庆得隆中药饮片厂，批号16118014）；苦参（广东新兴永祥中药饮片厂，批号：180201）；地榆（广州至信中药饮片有限公司，批号：180701）；两面针（广东新兴永祥中药饮片厂，批号：180801）；白芷（肇庆得隆中药饮片厂，批号：DL150170323）；痔瘘宝洗剂（肇庆市中医院，批号：180329、180716、181015）；甲醇LC-MS（天津市四友精细化学品有限公司，批号：170714）；其他试剂为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺

根据处方特点和临床需要，该制剂用途为稀释后外洗或坐浴，故依据传统工艺全方用水煎煮后浓缩处理。为达到原料药的均一性，试验用的所有原料药打碎为过10 目筛的粗粒，混合均匀后再按试验量分为若干份。

2.2 设计正交试验

根据药材提取工艺中的加水倍数（A）、提取时间（B）、提取次数（C）等因素考察结果[4]（因素水平见表1），以大黄素的含量和干浸膏得率为指标，进行正交试验。评价指标的综合评分：以提取液中大黄素含量和干浸膏得率为标价指标，采用公式Z[5]=（60/大黄素含量max）×大黄素含量+（40/干浸膏得率max）×干浸膏得率）进行计算，使用统计软件SPSS 22.0 对数据进行分析。

表1 因素水平

2.3 测定干膏得率

用移液管精密量取供试品25 ml 置蒸发皿，在水浴锅中水浴蒸干后置105 ℃烘箱内干燥至恒重。得膏率（%）=干膏重量/原药材重量×100%。

2.4 大黄素的测定

2.4.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B[6]，按表2中规定进行梯度洗脱；检测波长为254 nm[7]，柱温30 ℃，理论板数按大黄素计算应不低于5350。见表2。

表2 痔瘘宝洗剂测定大黄素的色谱条件

2.4.2 对照品溶液制备精密称量大黄素对照品，加入甲醇制备成大黄素储备液，浓度为720 μg/ml。准确量取储备液1 ml 置于25 ml 容量瓶中，加入流动相溶液定容至刻度线，充分混合均匀后，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得对照品供试液，大黄素浓度为57.6 μg/ml。

2.4.3 供试品溶液制备取本品20 ml 置三角锥瓶中，加盐酸调节pH 值至2，水浴回流加热30 min，立即冷却，用乙酸乙酯振摇萃取3 次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，用蒸发皿蒸干，残渣加甲醇定容至10 ml，作为供试品溶液。

2.4.4 阴性对照样品溶液制备用缺大黄的阴性供试品[8]，加盐酸调节pH 值至2，水浴回流加热30 min，立即冷却，用乙酸乙酯振摇萃取3 次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，用蒸发皿蒸干，残渣加甲醇定容至10 ml，作为阴性对照样品溶液。

2.4.5 专属性试验分别抽取供试品、大黄素对照品、痔漏宝洗剂阴性（缺大黄）对照品5 μl 进入液相检测，结果如图1所示，表明在大黄素对照出峰的保留时间为15 min 左右，供试品同样出峰，且分离度好，阴性无干扰。

2.4.6 线性范围考察分别量取2.4.2 项下对照品储备液[9]，稀释成14.4 μg/ml、28.8 μg/ml、43.2 μg/ml、57.6 μg/ml、72.0 μg/ml，按2.4.1 项下色谱条件进样， 以进样浓度（μg）作为横坐标，峰面积作为纵坐标，进行回归方程的计算，得到大黄素的回归方程：y=19.688x－0.4001，r=0.9999。表明大黄素在72.0～360.0 ng 范围内呈现出良好的线性关系。

图1 HPLC 色谱图(A 为对照品；B 为供试品；C 为阴性对照)

2.4.7 精密度试验精密量取对照品5 μl，每隔0.5 小时进样1 次，共6 次[10]，结果显示相对标准偏差（RSD）=0.75%，表明仪器精密度良好。

2.4.8 重复性试验按2.4.3 项下方法，同法制备6 份供试品溶液[11]，精密量取5 μl，分别进样，结果显示6 份供试品的大黄素含量的RSD=1.03%，结果表明本试验条件的重复性较好。

2.4.9 稳定性试验精密量取对照品5 μl，每隔2 小时进样1 次，记录大黄素的检测峰面积，结果RSD= 0.91%，表明配制溶液8 h 内稳定性良好[12]。

2.5 正交试验测定结果由表3综合评分可知提取条件对工艺的影响[13]大小依次为C＞B＞A，提取的最佳条件为A2B3C3。从表4方差分析得知，提取次数（C）对工艺有显著性影响，A 和B 对工艺的影响不显著，考虑到大生产降低成本和缩短生产周期，选择A2B2C3，即加水量为原药材10 倍、提取3 次，每次1.5 h。

为确定本试验的准确性，按上述确定提取方法[14]，即加水量10 倍，提取3 次，每次1.5 h，结果测定出大黄素平均55.33 μg/ml（n=3，RSD=1.05%）。由验证结果可知，本方案准确有效。

3 讨论

以大黄素为内参[15-16]，验证一测多评大黄五种成分的方法是合理可行的，故本文选择大黄素为检测指标具有重要意义；该制剂为纯水提物，干浸膏得率能整体反映提取的效率，具有现实意义。

2015 版《中华人民共和国药典》中，大黄的提取方法是采用回流放冷后用乙醚萃取，笔者考虑到乙醚属于“易制毒”试剂，购买时需要至公安局进行，购买手续繁杂，不便于以后实际工作，故使用溶剂极性排行表[17]与乙醚靠近的乙酸乙酯进行萃取。用乙酸乙酯替代乙醚的试验方法是首先采用薄层色谱法，即以硅胶G 作固定相，用普通毛细管将乙酸乙酯和乙醚萃取样品在同一硅胶G 薄层板上进行点样，结果在相同的位置呈现的同等数量和颜色斑点是一致的；其次是采用高效液相分析所提取的大黄素含量，即采用自动进样器分别吸取5 μl 乙酸乙酯和乙醚萃取的样品进样，结果二者的色谱峰面积基本一致，故使用乙酸乙酯替代乙醚萃取大黄素方法是可行的。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

在提取大黄素过程中，笔者曾使用乙酸乙酯萃取后分别上硅胶柱，分别用50%甲醇洗脱、石油醚∶乙醚8∶2 洗脱、石油醚∶乙酸乙酯5∶5 洗脱、石油醚∶乙酸乙酯3∶7 洗脱、石油醚∶乙酸乙酯1∶9 洗脱，结果石油醚∶乙醚8∶2 洗脱时供试品前面的杂质峰最少，但大黄素的测量得率降低较多。为了减少损耗，降低实验误差，在该方法测定大黄素分离度好的情况下，笔者最终选择乙酸乙酯萃取后蒸干加甲醇作为最终的供试品制作方法，以保留大黄素的最大含量。

根据《广东省医疗机构制剂规范》中痔瘘宝洗剂鉴别法“乙醚萃取后蒸干”“残渣加乙酸乙酯溶解”，笔者亦试用此方法作对比，结果采用乙酸乙酯溶解供试品的色谱峰出现严重的溶剂前沿，用甲醇溶解的液相色谱峰峰型对称，几乎没有溶剂峰。由于直接使用甲醇较配制流动相方便，所以最终确定用甲醇溶解。

高效液相检测流动相的选择：笔者曾按2015 版《中华人民共和国药典》中大黄含量测定方法（甲醇∶0.1%磷酸溶液=85∶15，C18色谱柱（安捷伦））试验，结果大黄素在4.4 min 出峰，大黄蒽醌的最后一个色谱峰（大黄素甲醚）亦在7.5 min 出峰。由于中药制剂成分复杂，出峰时间过早，容易与杂质峰重叠，影响分离度，故本流动相开始用降低甲醇的比例至50%来加快极性大的杂质出峰，推迟大黄中的蒽醌出峰，确保大黄素的分离度达到要求，3～5 min调整甲醇比例至70%亦是使杂峰与大黄蒽醌更好的分离；5～17 min 逐渐调整甲醇比例至86，使大黄蒽醌出峰分离，20～22 min 调整甲醇至50%使流动相比例恢复初始状态，22～25 min 保持甲醇比例50%使基线达到平衡。从图谱上看，大黄5 种蒽醌的出峰的初末时间差由原来“药典方法”的5 min 变至10 min，除保留时间最短的芦荟大黄素有一肩峰外，其余4 种蒽醌的分离度好，达到检测要求。

本研究由肇庆高等医学专科学校与肇庆市中医院利用各自的优势，联合起来进行该课题的研究，根据广东省食品药品监督管理局《关于进一步加强医疗机构制剂配制监督管理工作的通知》要求，按《广东省医疗机构制剂质量制订的技术要求》，参照药典和文献，重新修订其质量标准和工艺，使其达到《中国药典》的先进水平，为保证该制剂的安全有效提供强而有力的技术支撑。