EDTA处理土壤残留液对微生物群落的影响

赵金博，肖依林，王柳依，杨萌，彭海燕，程鹏飞

（北京师范大学环境学院水环境模拟国家重点实验室，北京100875）

重金属多具有不可降解性，进入土壤之后能够长久存在，因此对土壤质量造成了严重的威胁。随着科学技术的急速发展，工业生产得到了大规模的扩张，因而促进了矿产资源的大量开发利用。与此同时，农业的发展使得各种农药及化肥得到了更为频繁的使用，含重金属的污染物由此进入环境，造成土壤污染日益严重。目前，世界各国土壤存在不同程度的污染，全世界平均每年排放Hg约1.5万吨、Cu约340万吨、Pb约500万吨、Mn约1500万吨、Ni约100万吨[1]。重金属污染物不能被化学或生物降解、易通过食物链途径在生物体内积累，毒性大，对生态环境、食品安全和人体健康构成严重威胁[2-4]。正因如此，土壤重金属污染修复技术已成为研究热点。

目前，重金属污染土壤的修复技术研究取得了长足发展，主要包括物理、化学、生物、农业生态和联合修复技术。土壤淋洗技术是将水或含有冲洗助剂的螯合剂（柠檬酸、EDTA、DTPA、EDDS）、酸/碱溶液、表面活性剂等淋洗剂注入到土壤或沉积物中，洗脱和清洗土壤中污染物的过程[5-6]。化学螯合剂能够活化土壤中存在的重金属，以促进植物的富集，进而强化植物对土壤中重金属的吸收[7-8]。EDTA是一种在土壤重金属污染治理中应用较广且效果较佳的络合剂，其原理是EDTA能够与重金属结合成一种具有较强结合力的络合物，这种结合力大于土-重金属间的结合力，进而通过土液分离的方法将其从土壤中分离出来达到去除重金属的目的[9]。EDTA对微生物群落丰富度的影响已有文献报道[2-4]，王学峰等[14]的研究表明，EDTA处理的植物叶片在1周后有失绿、黄化等中毒症状发生，四川黄芥地上部和根部的干重相对于对照处理均有显著降低，生长受到明显的抑制，其生物量随EDTA浓度的增加持续下降。史鼎鼎等[15]研究了EDTA处理对黑麦草生物量的影响，发现抑制了黑麦草生长，随着Pb、Cd浓度的提高，EDTA处理的黑麦草总生物量提高，但其对黑麦草根系的损害更为显著。

自然界中的土壤本身并不含有EDTA的成分，即便是被重金属严重污染的土壤中也是同样。EDTA的使用在去除土壤中重金属的同时，其残留液可能也对土壤生态系统产生影响。为此，本文主要针对EDTA残留液浓度与土壤微生物生长之间的关系进行定性与定量分析。为EDTA在土壤残留液的浓度对微生物群落的影响提供数据支撑。

2 材料与方法

2.1 实验设计

用不同浓度梯度的EDTA处理土壤，悬浊液中的微生物培养，并对微生物的总量进行计数，同时比较不同微生物之间的数量差异。对EDTA处理后的悬浊液理化性质进行测定，探究EDTA对微生物数目的影响。

本实验土壤样品为室内花盆土壤，土壤中重金属含量不详。过筛后分为5份，分别加入无菌水、5mmol/L EDTA溶液、10mmol/L EDTA溶液、50mmol/L EDTA溶液、100mmol/L EDTA溶液浸泡48h模拟EDTA处理后的土壤。之后各组浓度的悬浊液分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基和固体培养基中，每个实验组均设置3个平行样，以减小实验误差。在固体培养基上培养24h后用显微镜观察平板上的菌落类别，对于其中菌落形态明显不同的各微生物分别在显微镜下观察以确认差异。对于难以区别形态（微生物的细胞群体过于密集或细胞太小）的对象，采用格兰氏染色进行定性的区分；同时在液体培养基上用流式细胞仪对培养基内所有微生物进行计数，并且多次计数以探究不同浓度对于微生物整体数量的影响。

2.2 实验材料

本次实验应用到微生物培养操作。培养时使用牛肉膏蛋白胨培养基，恒温箱设定温度为37℃。实验使用EDTA处理土壤，浓度依次为0、5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L。革兰氏染色材料包括结晶紫染液、碘液、酒精及沙黄染液。依实验室内试剂浓度。

3 结果与讨论

随着EDTA浓度的增加，在平板上可以观察到的微生物种类由无菌水的7种降至100mmol/L的3种，直观得到了EDTA的浓度会对微生物种类造成影响的定性分析结果（图1）。即菌落数总体上随着EDTA溶液浓度的增大而减少，其中，在50mmol/L和100mol/L EDTA浓度下菌落的数目有明显减少。部分菌落在浓度为50mmol/L及以上的EDTA溶液中消失。然而在0～10mmol/L浓度直接微生物群落没有明显变化。以下是各个浓度不同种菌落在40倍光学显微镜下的图像，由于技术条件的限制，未能观察到不同EDTA溶液浓度下细胞的具体形态，因此，不同浓度的EDTA溶液对土壤微生物细胞的形态特征是否有影响还有待进一步研究。

图1 微生物生长状况

通过PI染色法用流式细胞仪计数分析不同EDTA浓度处理下土壤中微生物死亡数目统计结果如图2所示，依次为：对照组（A）、5mmol/L EDTA溶 液（B）、10mmol/L EDTA溶 液（C）、50mmol/L EDTA溶液（D）、100mmol/L EDTA溶液（E）。实验结果表明，在0～5mmol/L，土壤微生物的存活个数分别为45850和46737（图2，绝对计数值），死亡比均为0.08%，说明对照组与5mmol/L EDTA对土壤微生物总量影响不大。随着EDTA溶液浓度的增加略有上升，微生物总数死亡比略有上升，达到10mmol/L的29%与50mmol/L的35%；然而当EDTA浓度达到100mmol/L时，土壤微生物的死亡比值达到73%（见图3）。经过线性关系分析后得出，EDTA浓度与细菌死亡比的关系式为Y=0.1563X-0.1615（r2=0.87），结果表明，土壤中的EDTA浓度与土壤中微生物死亡数目呈现出正相关性。

图2 流式细胞仪数据分析

图3 不同浓度EDTA对微生物死亡比的影响

3 总结

本实验发现，当土壤EDTA残留液低于5mmol/L时，48h培养实验并未发现微生物种类明显减少，活体微生物总个数与对照组相近，证明EDTA对土壤微生物几乎没有影响；当土壤EDTA残留液高于10mmol/L时，土壤残留液中EDTA是对土壤微生物生物多样性有抑制作用，且浓度越高，微生物的生物多样性明显降低，总群落个数死亡数目也逐渐升高。通过线性回归发现土壤中的EDTA浓度与土壤中微生物死亡数目呈现出正相关性。本文证明EDTA虽能去除土壤中的重金属成分，但对土壤微生物环境也有整体上的影响，进而影响到整个土壤微生物生态系统的稳定。因此EDTA在应用于土壤修复中应该注意控制其土壤残留液浓度小于5mmol/L，此浓度下可降低其对微生物的影响。