转化生长因子βⅡ型受体胞外域融合蛋白的体内抗肝纤维化活性研究

蔡燕飞，万爱妮，陈 蕴，金 坚

(江南大学药学院药物设计与分子药理学实验室，无锡 214122)

我国是肝病大国，肝硬化是主要死亡原因之一，肝纤维化是肝硬化的早期阶段，两者的病理发展过程类似，当肝纤维化患者得不到良好治疗时，纤维化程度以“滚雪球”的方式不断恶化，最终发展为肝硬化，慢性肝损伤大多都发展到了肝硬化[1]。随着对肝硬化病理及生理学广泛而深入的研究，很多研究表明肝纤维化阶段肝脏处于一种动态平衡状态，肝纤维化在一定程度上是可逆的。因此，在早期肝病阶段进行及时、有效的治疗，缓解肝脏压力从而改善肝脏状态，对各种肝脏疾病有重要意义。

近年来，肝纤维化的细胞因子治疗成为研究热点[2-4]，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是已知的最强促肝纤维化因子，是一个重要的纤维化治疗靶标[5-6]，应用转化生长因子βⅡ型受体胞外域(extracellular domain of transforming growth factor beta type II receptor,eTGFBR2)，能拮抗TGF-β1活性，发挥治疗肝纤维化作用[6-7]。然而单体蛋白药物在体内代谢过程中易被肾小球过滤或被蛋白酶降解，具有较短的循环半衰期，临床使用时必须高频或大剂量给药才能获得一定疗效，给肝纤维化病人带来了很大的痛苦[8]。因此，开发半衰期长、稳定性好的抗肝纤维化药物意义重大。

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)为人体血液中含量最高的蛋白，在维持血液稳定性方面有重要作用，体内半衰期很长并且生物相容性好，是理想型融合蛋白[9]。运用融合蛋白技术开发高利用率、高稳定性的抗肝纤维化药物可行性较大。本课题组前期已利用融合蛋白技术开发设计了稳定长效重组蛋白HSA-eTGFBR2，通过CHO表达系统可获得纯度超过90%的融合蛋白，为进一步研究体内生物学活性做好了准备[10-11]。

CCl4被广泛应用于肝纤维化、肝硬化动物模型的构建中[12]。水飞蓟素是天然保肝药，常作为抗肝纤维化研究的阳性对照[13]。本研究构建了CCl4诱导的肝纤维化模型，以水飞蓟素为抗肝纤维化阳性对照，通过病理组织学染色、肝功能检测及肝纤维化标志性蛋白的表达，探究了人血清白蛋白融合蛋白HSA-eTGFBR2的小鼠体内抗肝纤维化效果，并与eTGFBR2单体进行了药效对比，以期找到半衰期长、稳定性更好的抗肝纤维化药物。

1 材 料

1.1 试 剂

CCl4色谱纯、药用级玉米油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；总胆红素(TBIL)、透明质酸(HA)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒、苏木精-伊红(H-E)染液(南京建成生物工程研究所)；兔抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(美国Proteintech group公司)；兔抗Ⅰ型胶原蛋白(COL I)抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)；人eTGFBR2标准品(美国R&D公司)。

1.2 仪 器

正置显微镜(德国徕卡公司)；蛋白质电泳系统、蛋白质转印系统(美国伯乐公司)；凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)；烤片机(常州国华电器有限公司)。

1.3 动 物

BALB/c小鼠，雄性，体重(25±2)g，购自扬州大学比较医学中心(SPF级，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)。将小鼠分笼(每笼5只)，按常规条件(室温25 ℃，湿度55%，光照12 h/d)饲养，喂食普通饲料，自由摄取食物、饮水。饲养观察1周后进行实验。

2 方 法

2.1 动物模型建立及给药

研究表明，低浓度的TGFBR2(0.1 mg/kg)在每天给药的情况下，具有良好的抗小鼠肝纤维化效果，据此选择合适的给药方式设定实验分组[14-15]。

BALB/c小鼠随机分为6组，每组6只，具体分组及给药方式如表1所示，其中除了正常组和模型组，其他组均是在造模6周结束后再给药。

Table1 Group list of the animal experiment

GroupDrugRoute of administration DosageTimeNormalCorn oilIntraperitoneal injection2 mL/kgTwo times a week,every Monday and Thursday,for eight weeksModel25% CCl4 in corn oilIntraperitoneal injection2 mL/kgTwo times a week,every Monday and Thursday,for six weeksPositive con-trolSilymarinIntragastric administra-tion100 mg/kgEvery day,for six weekseTGFBR2eTGFBR2Tail vein injection1.2 nmol/kgEvery day,for two weeksHSA-eTGF-BR2HSA-eTGFBR2Tail vein injection1.2 nmol/kgEvery three days,for two weeksHSAHSATail vein injection1.2 nmol/kgEvery three days,for two weeks

HSA:Human serum albumin

2.2 实验动物取材

实验结束，各组小鼠于当晚禁食不禁水12 h，次日称重，腹腔注射8 mL/kg的4%水合氯醛麻醉，眼球取血，室温静置2 h，1 000 r/min离心15 min，收集血清于无菌EP管，保存在-80 ℃冰箱，用于后续肝功能检测。

之后将小鼠处死，解剖取肝脏，观察肝脏外形变化，称重，拍照，用生理盐水漂洗后，切取部分肝左叶，置于4%PFA中固定，用于后续石蜡包埋、切片、染色；切取另一份置于-80 ℃中保存，用于后续分子生物学检测。

2.3 制备肝组织切片

取经多聚甲醛溶液(4% PFA)固定的肝组织，依次经75%，85%，95%，100%，100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋；将石蜡标本用切片机做4 μmol/L切片，温水展平，贴到载玻片上，用于后续染色。

2.4 肝组织切片的苏木精-伊红染色

将“2.3”项下制备的肝组织切片进行苏木精-伊红染色，具体操作步骤参见说明书。

2.5 血清肝功能指标测定

应用试剂盒检测各组血清中的肝功能指标AST、ALT、TBIL及ECM主要成分(HA)。

2.6 Western blot检测肝组织中α-SMA和COL I的表达

从-80 ℃冰箱取出肝组织，液氮速冻，充分研磨，加入含PMSF的RIPA裂解液，每20 mg组织中加入裂解液200 μL，冰上裂解20 min，随后12 000 r/min、4 ℃离心10 min，吸取上清液，分装于0.5 mL EP管中，用BCA蛋白测定试剂盒测定各组总蛋白浓度。

用PBS稀释各组样品至相同浓度，每组上样量70 μg，通过Western blot实验检测各组α-SMA和COL I的表达。

Western blot操作步骤：蛋白质经12% SDS-PAGE胶分离后，电转移至NC膜上，电转条件为：100 V，60 min。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗稀释液(1∶1 000稀释)，室温孵育3 h，TBST洗涤3次，加入相应的HRP标记的二抗稀释液(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗涤3次后，用ECL化学发光试剂显色拍照。

3 结果与讨论

3.1 一般情况观察

正常组小鼠正常生长，体重逐渐增加，毛色光泽，无死亡现象；模型组小鼠前期因CCl4毒性作用，体重下降、毛色暗淡、活动减少、精神萎靡、摄食减少，病死率约15%，造模后期，体重有所回升，不再死亡。HSA组和CCl4停药组小鼠生长状况与模型组相比改善不明显。其余各加药组小鼠在给药后状态逐渐好转，摄食、活动均增加，精神好转，毛色恢复光泽，随时间延长，体重逐渐回升。

3.2 肝脏外观及肝指数变化

正常组小鼠肝脏外观呈鲜红色，表明光滑，质地柔软，形态正常，模型组小鼠肝脏肿胀，颜色变浅，失去光泽，质地粗糙，表面可见细颗粒；HSA组小鼠也出现肝脏肿大、质地变硬、有颗粒状表面现象，比模型组程度稍轻；其他药物治疗组小鼠肝脏肿胀减轻，颜色恢复红色，表面光滑，细颗粒逐渐消失，质地变软(图1)。

Figure1 Effects of HSA-eTGFBR2 on liver appearance of liver fibrosis mice

与正常组相比，模型组、HSA组小鼠肝重及肝脏指数均显著升高(P<0.001)；阳性组、融合蛋白HSA-eTGFBR2及其单体治疗组的小鼠肝重及肝脏指数均下降，不同程度恢复至正常组水平，与模型组相比有统计学意义(P<0.001)(见表2)。

GroupLiver weight/gLiver weight/weightNormal(n=6)1.301±0.073***0.056±0.006###Model(n=5)2.332±0.1050.096±0.004Positive control(n=5)1.355±0.043***0.052±0.004###eTGFBR2(n=6)1.651±0.117***0.062±0.009###HSA-eTGFBR2(n=5)1.689±0.094***0.062±0.007###HSA(n=5)2.311±0.0990.092±0.007

***P<0.001vsmodel group；###P<0.001vsmodel group

3.3 苏木精-伊红染色观察肝组织结构变化

各组肝组织切片的苏木精-伊红染色结果如图2所示，正常组小鼠肝脏组织结构清晰，肝细胞完整、排列整齐、条索明显，胞浆丰富均匀，未见纤维组织增生；模型组小鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞普遍变性、坏死，呈空泡样变，胶原纤维沉积，纤维组织增生扩大；阳性组组织结构与正常组相似；HSA组与模型组相比，肝细胞坏死程度有所减轻，但仍可见肝细胞水肿、呈空泡样，说明HSA蛋白也没有明显的抗肝纤维化效果。

HSA-eTGFBR2及其单体有稳定肝组织结构的效果，肝索界限较为清晰，肝细胞胞质相对均匀，基本无空泡样变，未见纤维组织沉积。结果表明，HSA-eTGFBR2融合蛋白可中和TGF-β1，拮抗其促肝细胞凋亡及肝纤维化作用，减轻肝纤维化症状，其治疗效果与单体相当。

Figure2 Effects of HSA-eTGFBR2 on the liver structure of liver fibrosis mice

3.4 各项肝功能指标变化

肝脏是人体的解毒器官，血清中肝功酶活性的升高或蛋白质水平的下降与肝损伤程度密切相关。血清中ALT活性与肝细胞损伤程度成正比，血清中AST活性随肝细胞病变程度增加而增高。运用试剂盒检测血清样本中ALT和AST的活性，结果如图3所示，与正常组相比，模型组的AST和ALT活性明显提高，提示CCl4促使细胞及其膜脂质过氧化，而线粒体是膜脂质过氧化反应部位，线粒体损伤，产生一系列有毒的活性氧簇，导致肝细胞氧化损伤、坏死，释放肝功酶至血液中。HSA组的两种酶活性与模型组相比略有下降，但无统计学意义，说明HSA并不能改善肝功能，并无抗肝纤维化效果。eTGFBR2治疗组和HSA-eTGFBR2治疗组皆能下调AST和ALT水平，提示提示TGF-β1参与肝细胞损害，eTGFBR2或HSA-eTGFBR2拮抗其活性后，能明显改善肝功能。

TBIL水平与肝实质受损程度相关，TBIL会随肝纤维化加重而显著提高。各组TBIL测定结果(图4)显示，模型组TBIL浓度比正常组明显升高，除HSA组与模型组相比无统计学差异，其他加药组皆明显降低，几乎接近正常组水平，结果表明CCl4诱导的肝细胞病变，使胆红素不能正常转化为胆汁，排泄受阻，血液中TBIL水平升高，eTGFBR2及其融合蛋白能遏制这一病变，改善胆红素的代谢，降低TBIL水平。

肝纤维化时，血浆中透明质酸(HA)含量升高。检测结果显示(图5)，模型组的HA含量与正常组相比明显增加，且具统计学意义，说明CCl4诱导肝纤维化形成。HSA组和对CCl4诱导的肝纤维化并无改善，而eTGFBR2及其融合蛋白皆使HA水平降低。

以上各项肝功能指标检测结果表明，CCl4诱导肝纤维化形成，HSA组对CCl4诱导的肝纤维化并无改善，融合蛋白HSA-eTGFBR2及其单体均能下调各项肝功能指标，使各项指标趋于正常水平，低频给药的融合蛋白体现了与其单体相当的治疗效果。

3.5 Western blot检测各组小鼠肝组织中α-SMA和COL I的表达水平变化

静止的肝星状细胞主要分布在肝窦周Disse间隙中，α-SMA也分布于Disse间隙及中央静脉管壁。随着肝纤维化发展，肝星状细胞活化并向损伤部位迁移、增殖，α-SMA阳性细胞增多，表达上调。实验结果显示(图6-A和6-B)，CCl4诱导的肝纤维化模型组的α-SMA的蛋白表达水平皆高于正常组，两融合蛋白HSA-eTGFBR2及其单体皆能降低α-SMA的水平，与阳性组效果相当，显示出较好的抗肝纤维化效果。

自由基导致的细胞损伤是肝细胞毒性的主要机制，脂质过氧化是CCl4致肝硬化的原因，随后，氧化应激引起脂质过氧化、线粒体功能障碍，及ATP减少。脂质过氧化产物能刺激胶原蛋白基因COL I表达及羟酰胺羟化酶活性，从而促进纤维化形成。实验结果显示(图6-C和6-D)，融合蛋白HSA-eTGFBR2及其单体皆能抑制COL I蛋白的表达，减少胶原沉积，从而抑制肝纤维化。该组实验同样证明了，在降低给药频率的情况下，融合蛋白HSA-eTGFBR2依然能下调肝纤维化标志物α-SMA和COL I蛋白的表达水平，其疗效与单体药物相当，显示出更加稳定的抗肝纤维化效果。

4 小结与讨论

本研究成功构建了CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，融合蛋白HSA-eTGFBR2能明显减轻肝细胞损伤及胶原沉积，促进肝脏组织结构恢复，改善肝功能，降低肝纤维化标志物α-SMA和COL I的表达水平，改善肝纤维化症状，其治疗效果与单体药物相当。然而，在给药过程中，在等摩尔浓度前提下，单体药物需要每天给药，而融合蛋白药物只需3 d给药1次即可达到同样的药效，表明融合蛋白在降低了注射频率的情况下，体现了与单体药物相当的治疗效果，提示融合蛋白质药物半衰期更长、更稳定，具有更优的应用前景。

***P<0.001vsmodel group

然而，HSA-eTGFBR2想要真正成为抗肝纤维化药物依然任重道远，如：(1)该产品的肝特异性的、无肝细胞毒性、安全性等等均需要有进一步的评估;(2)本研究使用的融合蛋白的表达系统为CHO表达系统，前期实验结果显示该表达系统制备的融合蛋白虽然活性高，但是其产量并不理想[7]，需要进一步研究提高其转录水平及表达量，才能为后期的成药打下基础;(3)虽然本研究建立的模型优势众多，也能很好地反映药物效果，然而跟人体肝纤维化依旧有所差别，可以考虑应用大型动物(如灵长类)构建肝纤维化模型，为融合蛋白的成药性提供更有力的依据;(4)本研究运用细胞因子进行抗肝纤维化评价，呈现出较好的体内活性，在此基础上，也可以参考该方法去评价具有抗纤维化潜力的其他因子，最终实现多种细胞因子联合治疗肝纤维化的目标，为肝纤维化的治疗及细胞因子的应用提供借鉴。