抗结核药物致肝损伤动物模型的探讨*

张 冬，胡宝翠，王小红，吕博松，周灏微，韦丽琴

(1.包头医学院公共卫生学院2017级研究生，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院公共卫生学院本科生；3.包头医学院统计教研室 )

结核病的治疗目前主要采用四种药物的联合治疗：异烟肼(INH)、利福平(RIF)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)。在我国，结核病控制项目的标准化疗的给药方案是2H3R3Z3E3/4H3R3[1]。结核病的控制策略是短程督导化疗，可分为强化治疗阶段和巩固治疗阶段[2]。在强化治疗阶段以INH、RIF、PZA和EMB联合应用2个月，巩固治疗阶段以INH、RIF应用4个月[3]。在强化治疗阶段的2个月，由于四药的联合应用，往往更容易导致药物副作用的发生。其中，抗结核药物导致的肝损伤(Anti-tuberculosis Drug-Induced Liver Injury，ADLI)是抗结核治疗过程中的主要不良反应之一。据统计截止到2018年在中国大陆地区，引起药物性肝损伤的最主要药物中抗结核药占21.99 %[4]。研究人员通过建立较完善的肝损伤动物模型，为后续研究ADLI的发生机制及其防治提供一定的实验基础。虽然目前对ADLI大鼠模型的制作有着不同的方法，且在用药方法、造模时间、使用的方法上不尽相同，但大多数都是使用自己配置的药物，而使用临床上广泛应用于防治结核病的复方制剂，即乙胺吡嗪利福异烟片(Ⅱ)造模的文章较少，为了更接近临床用药方案，所以本实验拟通过建立不同剂量乙胺吡嗪利福异烟片(Ⅱ)导致的大鼠肝损伤实验模型，以确定抗结核药复合制剂致大鼠肝损伤的造模方案。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选用SPF级的健康SD大鼠，雌雄各20只，体重为190±10g(购买于中国食品药品检定研究院，许可证号：SCKX(京)2017-0005)。饲养于实验室动物房，温湿度适宜，通风情况良好，适宜大鼠生长发育。按30 g/d的标准给予普通饲料饲养，自由饮水(本动物实验已通过包头医学院伦理委员会批准予以开展，符合国家实验动物福利伦理的相关规定)。

1.1.2主要仪器、药品和试剂 仪器：Thermo scientic超纯水制备机(UV-TOC/UF,美国Thermo公司)；离心机(TDZ4-WS，白洋离心机厂)；电子天平(0032291505，赛多利科学仪器(北京)有限公司)；Mindray BS-180VET 全自动血生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司)；微量移液枪(德国Eppendorf公司)。药品：乙胺吡嗪利福异烟片(Ⅱ)，(沈阳红旗制药有限公司，生产批号：1706161)其组成成分：每片含利福平0.15 g、异烟肼0.075 g、吡嗪酰胺0.4 g和盐酸乙胺丁醇0.275 g。试剂：总胆红素(T-BiL)测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司，生产许可证编号：粤食药监械生产许20010352号)。

1.2方法

1.2.1药物剂量设计与制备 乙胺吡嗪利福异烟片(Ⅱ)每片质量为0.9 g，体重在55～70 kg的成人每天需服用4片，依照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”来换算，可得人类与大鼠的用药剂量之比为1∶6.3[4]。可计算得出1倍抗结核药组用药剂量为0.378 g/kg(相当于结核病患者在强化治疗阶段的正常剂量)，以此类推得2倍组和5倍组分别为0.756 g/kg和1.89 g/kg。将药片碾磨成粉末状溶于生理盐水中，制成灌胃液，1次/d。

1.2.2动物模型的建立 适应性喂养大鼠1周后按体重随机分成空白对照组、1倍抗结核药组、2倍抗结核药组和5倍抗结核药组，每组10只，雌雄各半，其余条件均相同。1倍、2倍、5倍抗结核药组按设定剂量灌胃，空白对照组给予等毫升的生理盐水，连续灌胃21 d。每7 d称一次体重并记录，根据体重变化调整大鼠的灌胃剂量。首次灌胃前，大鼠隔夜禁食禁水12h后于眼眶后静脉取血，用全血生化仪测定肝功基线指标。灌胃21 d后禁食禁水12h，腹主动脉取血，测肝功指标，并剖取肝脏，洗净后用滤纸吸尽表面的水分，观察形态并拍照记录。

1.2.3血液检测指标 血液样本置于离心机内以3 000 r/min离心15 min后，取上清液用全自动血生化仪测定ALT、 AST和T-BiL的含量。

1.2.4肝脏病理组织学检测 处死大鼠后立即切取大鼠肝脏有异常的部位，先使用10 %甲醛溶液固定，经过脱水处、石蜡包埋、切片后进行苏木素-伊红(HE)染色。最后在光镜下观察其病理改变，评价其肝脏损伤程度。

1.2.5统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件建立数据库并进行数据处理，采用表示动物肝脏功能的相关生化指标。各组大鼠三项肝功指标均不服从正态分布的条件，所以多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验，两两比较采用Mann-Whitney U法，ɑ=0.05。

1.3质量控制 实验开始前对所有参与该实验的人员进行现场培训,让相关人员掌握物品、器械、具体的灌胃、取血方法，以及动物饲养和实验过程中的所有操作细节和注意事项，并对鼠笼进行日常维护和消毒；在使用仪器设备前对仪器进行校正；由2名病理科专家分别进行独立盲法读片，若结果不一致则有第3位病理科专家再次读片，直至意见统一。

2 结果

2.1大鼠一般情况观察 研究期间观察可见，空白对照组大鼠食欲良好、精神佳，毛发光泽度好且未见黄染，尾巴及大小便颜色均无异常，体重正常增长；1倍抗结核药组大鼠食欲、精神良好，毛发光泽度较好，有轻微黄染，大小便可见少许变色，灌胃21 d后无明显不适症状；2倍抗结核药组大鼠食欲、精神尚可，毛发光泽度一般，有黄染，小便颜色黄较1倍抗结核药组深，比5倍抗结核药组浅；5倍抗结核药组大鼠食欲、精神一般，毛发蓬乱，黄染严重且有掉毛现象，鼠脚掌、尾巴及大小便均呈橘红色改变，体重有所增长但比较缓慢。

2.2血清学改变 造模前四组大鼠三项肝功指标经Kruskal-Wallis H秩和检验均未发现差异。详见表1。

分析造模21 d后四组大鼠三项肝功指标可见：四组大鼠间血清中ALT的含量存在差异(P<0.001),进一步两两比较显示，5倍抗结核药组与其他三组ALT比较均有差异(P<0.001)。四组大鼠间血清中AST的含量存在差异(P<0.05),5倍抗结核药组与空白对照组、1倍和2倍抗结核药组分别相比均有差异(P<0.05)； 1倍抗结核药组和2倍抗结核药组进行比较也有差异(P<0.05)；四组大鼠间血清中TBIL的含量存在差异(P<0.001)，两两比较显示5倍抗结核药组与其他各组相比均有差异(P<0.001)； 1倍、2倍抗结核药组分别与空白对照组相比均有差异(P<0.001)。详见表2。

表1 造模前四组大鼠血清中ALT、AST和TBiL比较[M(P25IP75)]

表2 造模21 d后四组大鼠血清中ALT、AST和TBiL比较[M(P25IP75)]

注：a为与5倍剂量组比较,P<0.05；b为与空白对照组比较，P< 0.05；c为与1倍剂量组比较，P< 0.05

2.3肝脏形态及病理学变化 留取四组大鼠的新鲜肝脏观察可见：空白对照组、1倍抗结核药组和2倍抗结核药组大鼠肝脏形态正常，质软，颜色鲜红且肉眼未观察到明显病变；5倍抗结核药组大鼠肝脏与空白组相比体积稍有肿大，颜色较浅。

病理切片可见空白对照组大鼠肝细胞形态结构正常，肝索清晰可见，围绕着肝中央静脉呈放射状分布，无细胞水肿和脂肪变性；1倍抗结核药组肝脏切片可观察到门管区无炎细胞浸润，无明显病变；2倍抗结核药组肝脏切片可见小灶性脂肪变性，无炎性细胞浸润；5倍抗结核药组肝脏切片可见肝细胞发生脂肪变性，门管区可见炎细胞浸润，点状坏死。详见图1。

图1 各组大鼠肝脏形态学变化光镜图(HE,×400)

3 讨论

通过建立肝损伤动物模型，有利于对各种肝脏疾病发病机制以及对相应治疗药物的筛选等方面进行深入的研究。近年来，在对肝损伤模型的研究中，对乙酰氨基酚[6]、四氯化碳[7]、刀豆蛋白A[8]、酒精[9]等动物模型已经具备了成熟的制备方法，但在ADLI动物模型的研究中，由于存在给药种类、给药剂量以及给药时间的不同，因此动物肝损模型的构建上有着不同的方法。目前大鼠ADLI模型的制备方法中使用较多的的制备方法是口服INH+RIF各50 mg/(kg·d)，造模28 d[10, 11]；也有采用INH+RIF各75 mg/(kg·d)，连续灌胃 28 d[12]；或者INH+RIF各100 mg/(kg·d)，造模21 d[13]；此外单纯给INH 55 mg/(kg·d)造模28 d[14, 15]，100 mg/(kg·d)造模21 d[16]；除此之外还有采用自己配置的INH2 mg/(kg·d) ++RIF 50 mg/(kg·d) +PZA140 mg/(kg·d),造模45 d[17];也有采用自己配置的INH 80 mg/(kg·d) + RIF160 mg/(kg·d) + PZA8 mg/(kg·d) + EMB8 mg/(kg·d)，造模28 d[18]。通过比对以上不同的给药方案，并结合目前结核病控制项目的标准化疗的给药方案，同时考虑到药物适应性现象[19]的出现，以及该药物的参考文献[20]和预实验的结果，本研究最终采用与临床治疗相一致的乙胺吡嗪利福异烟片(Ⅱ)造模，按照1倍[0.378 g/(kg·d)]、2倍[0.756 g/(kg·d)]和5倍[1.89 g/(kg·d)]的灌胃剂量分别对三组大鼠灌胃21 d，构建由乙胺吡嗪利福异烟片(Ⅱ)导致的大鼠ADLI模型。从实验期间大鼠的生理状态来看，5倍抗结核药造模组的大鼠食欲、精神欠佳，易受惊吓，毛发蓬乱且黄染严重，且有出现掉毛现象，其脚掌、尾巴及大小便均呈橘黄色改变，体重增长缓慢。而1倍、2倍抗结核药和空白对照组均无显著病态改变。

肝脏作为人体重要的代谢和解毒器官，含有丰富的酶系统,当肝细胞受到损伤或破裂时，细胞质里的各种酶进入血液中，大大增加了血清中ALT和AST的含量，因此当血清中转氨酶(ALT和AST)的活性急剧升高时，标志着抗结核药对大鼠肝脏发生损害作用；另一方面，肝脏具有代谢胆红素的能力，当肝脏受到一定程度的损伤时，TBiL的值会发生显著性变化，造成胆汁淤积现象。因此这三项指标常用于肝功能检测[21]，以及肝损伤程度的判定[22]。本实验结果显示，1倍抗结核药剂量组与2倍抗结核药剂量组在处死时虽然在AST的含量上有差别，但是无法仅根据这一个指标进行判定，故不进行讨论。而在5倍剂量抗结核药的剂量下药灌胃21 d，由于肝细胞受损伤较严重，导致肝细胞对胆红素的摄取、结合及排泄功能降低，同时由于药物及其产物在体内大量累积，导致大鼠病态改变的出现，最终导致5倍抗结核药剂量组的ALT、AST和TBiL的含量和1倍、2倍抗结核药和空白对照组相比均有显著升高，按照肝损伤诊断标准[21]可诊断为药物性肝损伤。

另外，从解剖学角度来看，5倍抗结核药组肝脏稍有肿大现象，质脆，边缘较厚，与肝损的病变典型解剖学变化相一致，而1倍和2倍抗结核药组与空白对照组肝脏情况相似均无明显变化。由于病理学检测结果可更加直观的观察到肝脏的受损程度，因而常作为抗结核药致肝损伤的金标准[23]。本实验显示：2倍抗结核药组胞质疏松淡染，偶见脂肪变性，无明显坏死。5倍抗结核药组肝细胞存在一定程度的损伤，且从切片中可见肝细胞发生脂肪变性，门管区存在炎细胞浸润以及点状坏死；与一些文献[24，25]不同的是，本次实验中未见明显坏死灶和大量炎性细胞浸润，这可能与给药种类不同有关。不过，综合病理学检测结果以及肝功指标的变化，可以认为5倍抗结核药组与其他两个造模组相比造模效果更好。

综上所述，1.89g/kg剂量的乙胺吡嗪利福异烟片(Ⅱ)灌胃21 d可成功致SD大鼠出现肝损伤，因此使用5倍剂量在ADLI大鼠造模及相关实验中值得推广和应用。