K562白血病细胞中Musashi2干扰慢病毒载体的构建和鉴定

张慧娟，胡 蓉，江丽霞

(赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000)

Musashi 2 (Msi2)是一进化上高度保守的RNA结合蛋白[1]，可以与靶蛋白的mRNA3' 非翻译区(3' UTR)结合，抑制其下游靶基因的翻译[2]。作为细胞命运决定子，Msi2可调控多种组织细胞的不对称分裂，影响干细胞功能[3]。最近有研究表明，Msi2可以维持人造血干祖细胞的自我更新并促进其体外增长[4-6]，Msi2的缺失会导致造血干细胞的定向分化[7]。而Kharas等[8]发现，Msi2不仅在造血干细胞中高表达，抑制早期粒系和巨核系的分化，而且参与调控白血病的发生发展。Msi2可以维持骨髓增生异常综合征(myelodyplastic syndrome，MDS)干细胞活性并和MDS病人预后呈负相关[9]；在急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)中，无论是在mRNA还是蛋白水平，Msi2的高表达均与病人的预后呈负相关[8,10]。在慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)小鼠模型中，Msi2的表达在加速期或急变期显著高于慢性期[8,11]，过表达Msi2可促使CML由慢性期进入急变期；反之，急变期CML细胞中Msi2下调或缺失可以促使白血病细胞分化，小鼠生存率增加[11]。临床资料显示，高表达Msi2的CML病人预后往往不良，Msi2已成为CML早期预后标志之一[8,11]。以上研究表明，Msi2在白血病的恶性转变中起重要的作用。

本文通过构建干扰Msi2的慢病毒载体，包装成病毒后感染CML细胞株K562细胞，并进一步检测Msi2在K562细胞中的干扰效率，为以后研究Msi2在白血病中的功能和机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂嘌呤霉素购自Sigma公司，RNA逆转录试剂、脂质体2000转染试剂和定量PCR试剂TaqMan Real-Time PCR Master Mixes购自Invitrogen公司，MSI2抗体购自Abcam公司，Tublin抗体购自Bioworld公司，辣根过氧化物酶连接羊抗兔二抗购自中杉金桥公司，RPMI 1640培养基和DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司。

1.2质粒、菌种和细胞培养GV 248慢病毒载体、pHelper 1.0、pHelper 2.0病毒包装辅助载体购自吉凯公司，DH5α大肠杆菌，慢病毒包装细胞293T细胞、人白血病细胞株K562细胞均由赣南医学院第一附属医院研究中心保存。在37 ℃，5% CO2的条件下用含10%的胎牛血清，青霉素(100 U·mL-1)、链霉素(100 U·mL-1)和L-谷氨酰胺(2 mol·L-1)的RPMI 1640培养液培养K562细胞，DMEM培养液培养293T细胞。

1.3GV248-shMsi2载体构建由吉凯公司设计合成两组Msi2干扰片段和对照组片段，序列分别为shMsi2-1：5'ccggGAATGAAGATGTTGTGGAGAActcgag TTCTCCACAACATCTTCATTCtttttg3'，其中GAATGAAGATGTTGTGGAGAA为靶序列；shMsi2-2：5' ccggAGGCACAGAGGGTTTGGCTTTctcgagAAAGCCAAA CCCTCTGTGCCTtttttg3'，其中AGGCACAGAGGGTT TGGCTTT为靶序列；对照组(NC)片段序列为：5' TTCTCCGAACGTGTCACGT3'。通过连接，转化，鉴定和测序(送至吉凯公司)，获得连接正确的载体。

1.4转染、感染和筛选将GV248-shMsi2载体或GV248-NC载体分别与pHelper 1.0、pHelper 2.0病毒包装载体用脂质体2000转染试剂共转染于融合度达60%的293T细胞，转染48 h和72 h获取细胞上清，通过旋转离心法将病毒液与K562细胞共培养，随后用含嘌呤霉素筛选稳定转染GV248-shMsi2载体的K562细胞，方法见参考文献[12]。

1.5定量PCR检测收集各组K562细胞，PBS洗涤后用RNA提取试剂提取总RNA，按试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，为定量PCR做准备。定量PCR总体系包括：TaqMan Real-Time PCR Master Mixes，去离子水，PCR上游引物，PCR下游引物，模板cDNA。Msi2上游引物： 5' GTTATCTGCGAACACAGTAGTG3'; 下游引物：5' ACCCTCTGTGCCTGTTGGTAG3'；gapdh上游引物：5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3'; 下游引物：5' GAAGATGGTGATGGGATTTC3'。反应程序如下：预变性95 ℃ 30 s; 变性95 ℃30 s，退火20 s, 延伸72 ℃ 30 s，72 ℃采集荧光，共39个循环。融解曲线条件：(65 ～ 95 ) ℃每上升0.5 ℃采集1 次荧光，结果用2-△△CT表示。

1.6westernblot检测收集各组K562细胞，PBS洗涤后，加入预冷的RIPA蛋白裂解液和PMSF(RIPA∶PMSF体积比=100∶1)。在振荡器上震荡，充分裂解后，离心12 000 g ×5 min。上清液即为细胞总蛋白溶液。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，加入蛋白上样Buffer，混匀后沸煮5 min，-80 ℃保存。取总蛋白20 μg经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜上。放入5%BSA室温封闭2 h，加入TBST稀释的一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入TBST稀释的二抗，室温孵育2 h，再按前述方式洗膜。用ECL化学检测试剂显影。

2 结 果

2.1GV248-shMsi2重组质粒测序鉴定将酶切后的GV248-shMsi2重组质粒送DNA测序，测序结果中包含干扰靶序列和保护碱基。从图1可以发现，GV248-shMsi2-1质粒的测序完全测通，与目标序列一致，表明成功构建GV248-shMsi2-1重组质粒。但GV248-shMsi2-2质粒的测序中断，在测序经过shRNA靶序列时中断。在挑取另外一个单克隆送测序后，结果依旧如此。后续实验依旧保留GV248-shMsi2-2质粒，待干扰效率出来后处理。

A代表GV248-shMsi2-1质粒测序结果；B代表GV248-shMsi2-2质粒测序结果。

2.2下调Msi2后K562细胞内Msi2mRNA水平表达在K562细胞中，和对照组比较，shMsi2-1和shMsi2-2组中Msi2 mRNA水平均下降，分别降为对照组的3%和28%，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。为方便后续试验，本研究选取了干扰效率较强的shMsi2-1组作为后续实验研究，即为shMsi2组。

图2 干扰Msi2后K562细胞内Msi2 mRNA的表达

2.3下调Msi2后K562细胞内Msi2蛋白水平表达图3显示，在K562细胞中，和对照组比较，shMsi2组中Msi2蛋白水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 干扰Msi2后K562细胞内Msi2蛋白表达

3 讨 论

目前，研究发现Msi2和多种白血病的进展和预后相关，比如在成人B淋巴细胞白血病中，高Msi2表达的病人往往预后也越差[13]。在髓系白血病中，Msi2可通过调控细胞代谢基因来促进白血病的进展[14]。因此，深入探究Msi2在白血病细胞中的功能及机制显得尤为重要，其中，成功构建干扰Msi2的白血病细胞模型是关键。白血病细胞作为悬浮细胞，存在难转染和感染效率低下的问题。基于实验技术的成熟度，前期研究[15]是通过构建干扰Msi2的腺病毒载体来感染白血病细胞，虽然也能够达到下调白血病细胞中Msi2的表达，保证后续实验，但也存在一些问题：因为腺病毒感染是瞬时感染，因此在构建干扰Msi2的细胞模型时都必须重新感染；腺病毒用量大，荧光背景高，杂质也多；干扰效率不及慢病毒载体。

本文构建2个干扰Msi2的慢病毒载体，GV248-shMsi2-1和GV248-shMsi2-2。在测序时发现，GV248-shMsi2-1载体完全测通，但GV248-shMsi2-2载体测序中断，挑取另外一个克隆后测序，仍然是测序中断。究其原因，可能是oligo退火后形成的发夹结构影响了测序，也可能是shMsi2-2的高GC含量(shMsi2-2的GC含量是52.38%而shMsi2-1的是38.10%)影响了测序。由于shMsi2-2测序已测出的前半部分序列是与目标序列相一致，因此本研究仍将GV248-shMsi2-2载体用于后续实验。定量PCR实验表明，shMsi2-2组干扰效率达到72%。由此表明GV248-shMsi2-2也是一个有效的干扰载体。

后续实验进行病毒包装并通过药物稳筛获得稳定转染GV418-shMsi2载体的白血病细胞。稳筛后的细胞可扩增后长期保存，以后随用随取，避免多次感染的繁琐。此外，本文结果也表明：无论是在mRNA水平还是蛋白水平，采用干扰Msi2的慢病毒载体，其干扰效率非常高，几乎可以达到100%。因此，在白血病细胞中做基因功能研究时，最好采用慢病毒或与之类似的逆转录病毒载体。

本文成功构建了干扰Msi2的慢病毒载体，并显著沉默了K562细胞中Msi2的表达，为后续探究Msi2在白血病中的功能和作用机理提供技术支持。