重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）对雉免疫效果的研究

颜克旭，杨 辉，奉 佳，宁华杰，刘增再，谭 丹，薛 爽，王洪亮，朱红刚，王昌建

（1. 长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410013；2. 湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410019）

高致病性禽流感（HPAI）是养禽业的头号杀手，是具有极大公共卫生意义的人兽共患病。目前，在我国引起HPAI的病原包括H5和H7亚型流感病毒。我国对HPAI 防控采取免疫与扑杀相结合的综合措施[1]。但高免疫压力可使HPAI 流行毒株基因变异速度加快[2]，并导致免疫失败。2017 年暴发的家禽高致病性H7N9 疫情，给我国养禽业造成了严重经济损失，也带来了严重的公共卫生威胁。为有效控制禽间疫情，我国紧急启用了包含（H5N1 Re-8株和H7N9 H7-Re1 株）两个疫苗株的重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗[3]，以控制HPAI 的蔓延和扩散，并取得了显著的防控成效。

近年来，禽流感在野生鸟类、动物园珍禽中也有暴发[4]，不仅对珍稀家禽的繁育保护带来巨大挑战，还对人类健康造成很大威胁[5]。2015 年美国华盛顿地区发生雉鸡H5N2 疫情，死亡率达10%，患病雉鸡精神沉郁，全身多处发生炎症并表现出血症状[6]。因此，采取有效的预防措施，加强对野生禽类的保护，不仅可防止疫情的暴发，还可保护公共安全。雉属珍禽，俗称“野鸡”，部分品种已开始人工饲养，饲养价值较高。为掌握重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）对雉的临床免疫效果，本试验选择政府采购重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗，对农户饲养的雉进行注射免疫，跟踪观察免疫后的临床变化，并进行抗体水平检测，以期了解H5 和H7 亚型HI 抗体效价在雉体内的消长规律，为科学推荐雉等珍稀禽的免疫疫苗种类和免疫程序提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）：生产批号01721177，肇庆大华农生物药品有限公司生产。

1.1.2 主要试剂 禽流感病毒H5、H7 亚型血凝抑制试验抗原与阳性血清：购自哈尔滨维科生物技术开发公司；禽流感病毒H5、H7 亚型荧光RTPCR 检测试剂盒：购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.1.3 主要仪器和耗材 一次性96 孔血凝板（V 型底）、移液器、微量振荡器、低速离心机、ABI7500-FSAT 荧光PCR 仪等。

1.2 方法

1.2.1 试验分组与接种 试验于2018 年5 12 月在长沙市浏阳市淳口镇某生态养殖场进行。选取未免疫禽流感疫苗的30 日龄雉35 羽，设免疫组和对照组（免疫组25 羽、对照组10 羽），用脚环进行区分。30 日龄首免，51 日龄二免，免疫剂量为0.3 mL/羽，采用胸部肌内注射。对试验组、对照组在饲料、饲养环境等方面提供相同的条件。

1.2.2 免疫副反应观察 分别于免疫后 0、4、8、12、24、36、48、60 和72 h，观察群体临床变化并记录。

1.2.3 样品采集 分别在免疫前及免疫后14、21、28、35、49、77、105、133、161、189 d，采集试验动物血液样品，分离血清，-20 ℃保存待检。

1.2.4 检测 应用HA-HI 试验[7]检测血清中的H5（Re-8）、H7（Re-1）抗体，依据《2018 年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》（农医发﹝2018﹞17 号）进行判定，即抗体效价≥4log2判定为抗体合格，合格率（抗体合格的样品数占同组样品总数的比率）≥70%为群体免疫合格。

2 结果

2.1 临床观察

试验雉免疫（H5+H7）二价灭活疫苗后无不良组织反应产生，精神状况良好，食欲及生长发育正常。

2.2 H5、H7 亚型抗体

免疫前后的H5、H7 亚型HI 抗体效价检测结果见表1 和图1，合格率结果见表2 和图2，变异系数统计结果见表3。雉疫苗免疫后14 d，H5、H7 亚型平均抗体效价均上升至合格效价标准（4log2）以上，并获得70%以上的群体合格率。H5 亚型抗体有效持续期（平均抗体效价≥4log2、群体合格率≥70%）在105 d 以上，免疫组各时间点抗体效价整齐度高，变异系数在0.14~0.41 之间，平均变异系数为0.26；H7 亚型抗体有效持续期（平均抗体效价≥4log2、群体合格率≥70%）在189 d以上，免疫组各时间点抗体效价变异系数整齐度高，在0.12~0.32 之间，平均变异系数为0.23。

表1 免疫后不同时期的H5 与H7 亚型抗体效价检测结果 单位：log2

表2 免疫后不同时期的H5 与H7 亚型抗体合格率 单位：%

图1 免疫后各时期抗体滴度

图2 免疫后各时期抗体合格率变化

表3 免疫后不同时期的H5 与H7 亚型抗体效价变异系数

3 分析与讨论

从试验结果来看，免疫后0、14、21、28、35 和49 d，H5（Re-8 株）、H7（Re-1 株）抗 体合格率、平均抗体效价呈上升趋势，最高峰分别为（8.04 1.5）log2 和（8.04 1.5）log2。免疫49 d 后，H5 和H7 亚型平均抗体效价逐渐下降。由此可见，两种亚型的抗体消长规律基本一致，但是H7 亚型抗体滴度和维持免疫合格的时间要比H5 亚型高和长，差异极显著（P ＜0.01），说明（H5+H7）二价灭活疫苗中的H7 亚型毒株更能刺激机体产生免疫应答，但也有可能是疫苗生产中的配比不同导致的。

本次试验表明，（H5+H7）重组二价灭活疫苗能给雉提供有效保护。徐娟等[8]利用重组禽流感病毒（H5 ＋H7）二价灭活疫苗，对9 家养禽场8 万多羽家禽进行了免疫效果评价，发现政府统一供应的重组禽流感病毒（H5 ＋H7）二价灭活疫苗免疫副反应小，可放心使用，但需免疫2 次才能产生良好的免疫效果，与本试验结果一致，说明重组禽流感病毒（H5 ＋H7）二价灭活疫苗不仅适用于家禽，同样适用于野禽。

重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株）对雉具有良好的临床安全性，可产生明显的免疫保护。变异系数反映了试验数据的离散程度。本次试验疫苗的抗体效价平均变异系数均在0.5 以下，最低的仅为0.07，表明试验疫苗的免疫效果受个体差异影响很小，群体免疫的均一性良好。

目前农业农村部已经调整高致病性禽流感疫苗生产种毒，要求2019 年1 月1 日起停止生产重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株），使用新的重组禽流感病毒三价 灭 活 疫 苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re2 株）代替。本次试验的方法、过程和推荐免疫程序可以为后续的研究和生产提供一定参考，但新的重组禽流感病毒三价灭活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re2 株）对野禽的免疫效果有待进一步研究。

4 结论

本研究表明，（H5+H7）二价灭活疫苗对雉能产生良好的抗体反应，具有较好的免疫保护效果，抗体效价整齐度高，同时无免疫不良反应，疫苗安全有效。研究显示，该疫苗免疫49 d 后，抗体水平逐渐下降，133 d 后明显下降，群体免疫合格率低于70%，因此生产中推荐，30 日龄首免，51 日龄和5 月龄各加强免疫1 次。