4 例禽戊型肝炎病例的实验室诊断及ORF2 基因遗传进化分析

张 翔，刘丰波，马 冬，宋姗姗，刘 东，刘红祥，李 彬，王群义，栾栋祖，刘 平，邵三敏

（青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266000）

禽戊型肝炎病毒（avian hepatitis E virus，aHEV）属于肝炎病毒科、正戊肝病毒属B 种，是一种无囊膜的单股正链RNA 病毒，病毒颗粒呈圆球状，为二十面体对称结构，直径为27~32 nm[1]。世界范围内分离到的aHEV 主要流行4 个基因型：澳大利亚和韩国的基因1 型、美国的基因2 型、中国和欧洲的基因3 型、匈牙利和中国台湾的基因4 型[2]。aHEV 基因组包含3 个开放阅读框（open reading frame，ORF），分 别 为ORF1、ORF2 和ORF3。有研究指出，使用针对ORF2 设计的引物，扩增序列构建的进化树与全基因组序列构建的进化树一致[3]。

2018 年山东、辽宁、吉林、陕西的4 个产蛋期鸡群发病，临床表现为：大群精神良好，采食饮水正常，但持续出现打蔫，每天出现零星死淘，日死淘率为0.1%~0.2%，病程可持续1~2 个月，累计死亡率为5.0%~15.0%。采集病鸡肝脏和脾脏提取RNA，利用RT-PCR 对aHEV-ORF2 基因进行扩增并测序，以期为aHEV 的诊断和深入研究提供分子生物学依据，为我国禽戊型肝炎防控措施的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集自山东、辽宁、吉林、陕西4个地区鸡场中疑似aHEV 感染的肝脏和脾脏样品，无菌处理后，置于-20 ℃保存备用。

1.1.2 试剂 RNAout 提取试剂盒：购自天恩泽生物公司；HiScript®II One Step RT-PCR Kit：购自诺唯赞生物公司；DL 2 000 bp DNA Marker：购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照GenBank 已公布的aHEV-ORF2 基因核苷酸序列，利用Oligo 6.0 引 物 设 计 软 件，设 计 扩 增aHEV-ORF2 基因的特异性引物。上游引物：aHEV-ORF2-F:5'-F CCCAGCCGGAAGCAGGCGCGG-3；'下游引物：aHEVORF2-R：5'-GGGTGGTGAGGGGAATGTCCTAC-3'。引物由北京华大基因科技有限公司合成，预期扩增目的片段为1 700 bp。

1.2.2 核酸提取 按核酸提取试剂盒和核酸提取仪说明书提取组织RNA。

1.2.3 核酸扩增 用 RT-PCR 一步法试剂盒扩增cDNA：45 ℃反转录30 min；94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s；53 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共30 个循环，72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存10 min。PCR 产物用1.0% 琼脂糖凝胶进行电泳，置于凝胶成像系统中观察结果。

1.2.4 序列分析 挑取阳性样品产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。用MegAlign 和Mega 6.0 软件对测定的aHEV-ORF2基因序列与GenBank 中部分代表性毒株序列进行同源性比较和遗传进化分析。

1.2.5 数据统计 统计不同地区发病鸡群的品种、日龄、日死淘率以及检测样品的PCR 阳性率。

2 结果

2.1 病鸡剖检变化

剖检病鸡可见：肝脏肿大、出血、轻微黄染，有小的或斑状的坏死点或坏死斑；肝脏易碎如泥，被膜下有凝血块（图1-A）。脾脏肿大，为正常的2~3 倍，破裂出血（图1-B）。腹部出现卵黄性腹膜炎（图1-C），卵泡萎缩、变形，有的呈“钟摆状”（图1-D）。

图1 临床发病鸡剖检变化

2.2 RT-PCR 检测

对送检样品处理后进行RT-PCR 检测，发现送检的4 份样品检测到的目的条带大小均约1 700 bp，与目的片段大小一致（图2）。将测序结果与GenBank 比对，结果均为aHEV 阳性。

图2 分离株的RT-PCR 鉴定结果

2.3 统计分析

4 个地区的鸡群均在产蛋期（196~480 d）发病，品种为蛋鸡和肉种鸡，日死淘数量为10~30只（表1）。

2.4 ORF2 核苷酸序列同源性分析

对4 个分离毒株的ORF2 核苷酸序列，利用MegAlign 进行同源性比较。结果（图2）显示，分离株间的ORF2 基因同源性为84.5%~94.5%，分离株与基因1 型的澳大利亚株和韩国株同源性为81.6%~82.8%，与基因2 型的美国原型株和无毒株同源性为80.9%~82.8%，与基因3 型的欧洲株和中国株同源性为80.8%~82.5%，与基因4 型的匈牙利株和中国台湾株同源性为81.4%~82.6%。4 株分离毒株ORF2 核苷酸与已报道的4 个基因型同源性均较低（＜84%）。

表1 4 个地区发病鸡群RT-PCR 检测情况统计

2.5 ORF2 基因遗传进化分析

利用Mega 6.0 对4 株分离株的ORF2 基因进行序列比较，绘制遗传进化树。结果（图3）显示：4 株aHEV 均属于戊型肝炎B 种，形成独立的基因分支，但不属于已报道的4 个基因型。

3 讨论

上世纪八九十年代开始，澳大利亚、美国、加拿大等陆续报道了鸡的大肝大脾病（big liver and spleen disease，BLS）或肝炎脾大综合征（hepatitis-splenomegaly，HS）[4-5]，2001 年 分 离到病毒并将其命名为aHEV[6]。早在1994 年我国就有该病抗体阳性的报告，2010 年从肉种鸡群中分离到aHEV[7]，2014 年从海兰褐鸡群中分离到基因3 型aHEV[8]。血清学调查发现，我国南方鸡群aHEV 血清阳性率约为33.0%[9]，广东、山东、黑龙江等地的鸡群血清阳性率约为28.3%。这些血清学调查结果均显示，我国已有aHEV 的广泛流行[10]。但血清学调查结果只能反映鸡群的抗体水平，无法确定鸡群的带毒情况。因病毒分离难度较大，而分子生物学方法操作简单、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好，已被广泛应用于临床检测。ORF2 基因编码蛋白是aHEV 的结构蛋白，其扩增序列构建的进化树与全基因组序列构建的进化树一致，是目前国内外主要的分型依据。

通过RT-PCR 方法，对山东、辽宁、吉林、陕西4 个地区发病鸡群采集的肝脏和脾脏进行检测，均检测到aHEV 阳性，此疾病在蛋鸡和肉种鸡的产蛋期均易流行，持续时间较长，累计死淘率较高，应引起养鸡企业的高度重视。

图2 aHEV-ORF2 基因部分序列同源性分析结果

图3 aHEV-ORF2 基因遗传进化树

测序分析发现，检出的4 株aHEV 均属于戊型肝炎B 种，不属于现已报道的4 个基因型，为新亚型。核苷酸同源性比对分析发现，4 株aHEV与已报道的4 个基因型代表株同源性均较低（＜84%），4 株分离株之间同源性为84.55~94.5%。目前尚无关于aHEV 新亚型的相关报道，本研究为我国进一步的aHEV 研究提供了基础和依据。

虽有报道称，可采用免疫亚单位疫苗防控aHEV[11]，但目前尚无商品化疫苗可用，因此养鸡场只能通过加强生物安全防止本病传入。

4 结论

本研究确诊了山东、辽宁、吉林、陕西4 个地区引起鸡群异常死淘的病因为aHEV 感染；通过ORF2 基因序列比较，发现分离株均属于戊型肝炎B 种，形成独立的基因分支，为新亚型。本试验为我国的aHEV 深入研究提供了基础和依据。