血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA联合检测对非小细胞肺癌的诊断价值研究

陈 坚，王 棣，向小俐，周 让

（1.叙永县人民医院检验科，四川 叙永646400；2.重庆合川区中医院检验科，重庆401520）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%［1］。NSCLC患者的5年生存率仅为11%～15%［2］。约有75%的NSCLC患者在确诊时已处于中晚期，这是引起患者预后较差的主要原因［3-5］。目前，临床诊断NSCLC的指标主要是细胞角蛋白19片段（cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），但两者的灵敏度分别为60%～70%和50%～65%，特异性分别为65%～85%和60%～75%［6-8］，仍然不能满足临床需求。

胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是与DNA合成、细胞增殖密切相关的酶，在多种肿瘤中均有异常表达，被证实与NSCLC预后明显相关［9］；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147）可诱导细胞基质金属蛋白酶类的产生，促进肿瘤细胞的侵袭迁移，在NSCLC组织中，其表达有增高趋势［10］；血管内皮细胞生 长 因 子 （vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是诱导肿瘤组织新生血管形成的关键因子，与肿瘤的营养供应及生长过程密切相关，已被证实参与了NSCLC的发病［11］。上述三项指标可分别从细胞增殖、侵袭、营养供应等三个方面反映肿瘤的发生发展过程，且都被证实与NSCLC的发病有关。我们推测联合检测上述三项指标对NSCLC的诊断及发病风险预测具有重要价值，而目前尚无上述三项指标联合应用于NSCLC的相关报道。本研究旨在探究联合检测血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA对NSCLC诊断与发病风险评估中的潜在价值。

材料和方法

1 研究对象

收集2016年5月至2018年4月期间在我院经病理确诊的NSCLC患者120例作为病例组，包括Ⅰ～Ⅱ期患者77例，Ⅲ～Ⅳ期患者43例。其中男性72例，女性48例；平均年龄51.3±5.1岁；平均体质指数（body mass index，BMI）为24.2±1.9 kg／m2；吸烟者57例；饮酒者34例。120例患者中鳞状细胞癌78例，腺癌26例，大细胞癌16例。NSCLC诊断标准参照NSCLC诊断指南［12］。肺癌的分期参照国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）第七版肺癌TNM分期标准［13］，其分型依据来自于病理检查结果。同期选取我院收治的患有肺部良性疾病患者120例作为对照组（支气管扩张60例、错构瘤20例、支气管囊肿17例、纤维瘤10例、真菌性肺炎7例和其他良性疾病6例）。其中男性69例，女性51例；平均年龄50.8±4.7岁；平均体质指数为24.1±1.7 kg／m2；吸烟者60例；饮酒者30例。病例组和对照组在年龄、性别、吸烟史、饮酒史、BMI等的差异均无统计学意义（P＞0.05）。研究对象排除标准：①已在外院接受手术、放化疗或免疫治疗者；②患有其他恶性肿瘤、严重的心脑血管疾病及自身免疫性疾病等；③患者或其家属不愿意签署知情同意书者。本研究的开展经医院伦理委员会批准。

2 临床样本采集与检测方法

受试者禁食10 h以上，次日清晨由专业医护人员使用含促凝剂采血管抽取静脉血10mL，血液标本在1 h内于4℃条件下以12000 g离心力离心15min，收集上层血清进行相关指标检测。TK1采用ECL印迹免疫增强发光法检测，试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司，检测仪器为全自动化学发光图像分析仪Tanon 4200（上海天能科技有限公司）；CYFRA21-1和CEA检测采用化学发光法，试剂盒购于武汉博士德生物工程公司，检测仪器为AU5800全自动生化仪（美国贝克曼库尔特公司）；CD147与VEGF均采用酶联免疫吸附法测定，试剂盒购买于武汉默沙克生物科技有限公司，操作过程严格按照试剂盒说明书进行，简明步骤如下：所有标本经稀释（1∶100）后依次加入微孔板中与抗体室温孵育40 min（同时加入CD147浓度为10、5、0.5 ng／L的3个标准品、阳性和阴性对照；VEGF浓度为200、20、2pg／mL的3个标准品、阳性和阴性对照），洗板5次，在避光条件下加入酶标记的单抗室温孵育40min，再洗板5次，加入底物反应15 min后终止反应，于Nanodrop ND2000分析仪（美国赛默飞世尔公司）上检测吸光值（A）。

3 统计学处理

本研究应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。对于正态分布的数据，以均值±标准差（）表示。正态分布检验采用Shapiro-Wilktest法。正态分布数据两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较时采用单因素方差分析。率的比较采用卡方检验。受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分 析 计 算 血 清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA判别NSCLC的能力。Logistic回归分析计算血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA对NSCLC的风险预测。本次统计分析选择的检验水准为 α＝0.05。

结 果

1 研究对象的血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平

研究对象血清TK1（Shapiro-Wilktest值为0.852，P＝0.641）、CD147（Shapiro-Wilktest值为0.629，P＝0.538）、VEGF（Shapiro-Wilktest值 为0.732，P＝0.616）、CYFRA21-1（Shapiro-Wilktest值为0.950，P＝0.835）和CEA（Shapiro-Wilktest值 为0.772，P＝0.694）水平符合正态分布。与对照组相比，病例组的血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平显著增高，且差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 120例NSCLC患者与120例肺部良性疾病患者血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平的比较

2 血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平与NSCLC患者临床特征的关系

如表2、表3所示，血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA水平与NSCLC患者年龄、BMI、吸烟与否、饮酒与否、性别、病理分型等无显著关系（P＞0.05），而血清TK1、CD147和VEGF水平与肿瘤淋巴结转移及TNM分期显著相关（P＜0.05）。血清TK1、CD147和VEGF水平在发生淋巴结转移或Ⅲ～Ⅳ期患者中显著高于未发生淋巴结转移或Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05）。

表2 血清TK1、CD147和VEGF水平与NSCLC患者临床特征的关系

（续表2）

表3 血清CYFRA21-1和CEA水平与NSCLC患者临床特征的关系

3 ROC曲线分析

ROC曲线分析显示，血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA区分NSCLC与肺部良性疾病患者的AUC分别为：0.931（95%CI：0.877～0.984，P＜0.001）、0.902（95%CI：0.842～0.965，P＜0.001）、0.785（95%CI：0.701～0.872，P＜0.001）、0.685（95%CI：0.590～0.773，P＜0.001）和0.517（95%CI：0.424～0.613，P＝0.712）；在各指标约登指数为最大值时对应的灵敏度及特异性分别为：91.2%／82.2%、81.0%／90.9%、79.1%／80.4%、68.8%／61.4%和56.1%／53.7%；对应的临界值分别为：3.2pmol／L、5.4ng／L、88.7pg／mL、9.2ng／mL和4.9ng／mL（图1A）。当 联 合 血 清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA时，运用Logistics回归模型将上述TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA这5个指标（变量）拟合后得到的新的变量——“PRE-1值”，而后将“PRE-1值”代入ROC曲线进行分析，发现联合5种指标在区分NSCLC与肺部良性疾病患者的AUC为0.949（95%CI：0.905～0.998，P＜0.001，图1B），在“并联”检测时，约登指数为最大值时的灵敏度和特异性分别为93.6%和86.4%；在“串联”检测时，约登指数为最大值时的灵敏度为88.7%，特异性为93.0%。

图1 ROC曲线分析

4 风险评估

多元Logistic回归分析结果，见表4。单因素分析显示，血清高TK1、CD147和VEGF水平是NSCLC发病的危险因素（P＜0.05）；多因素分析显示，在校正年龄、BMI、吸烟和饮酒等因素的影响后，血清高TK1、CD147和VEGF水平仍是NSCLC发病的独立危险因素（P＜0.05）。

表4 血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA对NSCLC的预测价值

讨 论

肺癌是全球死亡率最高、发病率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一［1］。NSCLC早期症状不典型，大多数患者确诊时已发展至中晚期，五年生存率极低［2］。本研究通过对120例确诊为NSCLC患者外周血清TK1、CD147和VEGF进行分析，同时联合NSCLC相关肿瘤标志物CYFRA21-1和CEA，旨 在 探 讨 血 清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA检测与NSCLC临床病理特征及在NSCLC诊断中的价值。

在本研究中，我们发现血清TK1水平是NSCLC发病的高危因素，对NSCLC的诊断具有较高价值，这些结果与前期李树林等［14］的研究结果相一致，他们在NSCLC癌组织中检测到TK1蛋白的高表达，与本次在血清中检测到的高水平TK1相呼应，我们推测可能的原因是与癌组织细胞向外周循环中大量释放TK1有关。TK1是参与DNA前体物质合成的关键酶之一，与细胞的生长、分裂密切相关，在肿瘤发生的早期即出现增高［15］。此外，TK1水平可反映肿瘤细胞的增殖活性，这也解释了其水平在Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者中的增高最显著的现象。CD147是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，可通过多种途径诱导巨噬细胞产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），促进肿瘤细胞的侵袭转移。在本研究中，我们发现CD147在NSCLC患者中的水平显著高于肺部良性疾病患者，且高水平的CD147与NSCLC的分期相关，这些结果与近年来的报道相呼应。例如，王斯闻等［16］对NSCLC细胞株进行CD147基因沉默后发现，CD147基因沉默可进一步引起癌细胞内β-catenin、MMP2、MMP9的表达降低与Bax的表达增高，从而抑制细胞增殖和迁移。VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导肿瘤血管生成，维持肿瘤的继续生长。本研究发现，VEGF在NSCLC患者中显著增高，且其增高水平与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移相关，这些研究结果与前期李波等［17］报道的结果相一致，他们分别在癌组织和mRNA水平上应用免疫组化及核酸扩增技术分析并发现VEGF在NSCLC中高表达。值得注意的是，我们分析VEGF水平之所以在Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者体内的水平更高，可能的原因是与Ⅲ～Ⅳ期NSCLC肿瘤生长迅速、血供需求更大有关。

此外，我们还首次探究了联合血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA五项指标对NSCLC的诊断及风险评估价值，并发现联合五项指标可显著提高NSCLC诊断的灵敏度，且TK1、CD147和VEGF三者均为NSCLC发病的独立危险因素。值得注意的是，CYFRA21-1和CEA单因素及多因素分析均不是NSCLC的危险因素，我们推测可能的原因为：单因素分析结果显示CYFRA21-1的OR值为1.31（0.95～1.67），CEA的OR值为1.22（0.96～1.91），虽然提示两者均不是NSCLC危险因素，但两者95%CI的下限均接近1，我们认为是由于本研究纳入病例的样本量不足造成。本研究仍有如下不足：①本研究纳入的患者均来自于本院，这可能会对研究结果造成一定的偏倚影响，今后需要多中心的队列研究来进一步验证我们的结果；②本研究纳入120例NSCLC患者，纳入的例数仍然是有限的，后期需要更大样本量的研究来证实血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA在我国NSCLC患者诊断中的临床价值；③本研究中采用的血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA多个指标的联合模型虽然较各单独指标有较高的临床价值，但该模型的应用仍有待进一步的验证。

综上所述，本研究结果表明，联合检测血清TK1、CD147、VEGF、CYFRA21-1和CEA对NSCLC的诊断、发病风险预测均具有重要意义，有望为NSCLC的临床诊疗提供新的途径。