SAT在活动性肺结核疑似患者中的应用研究

2019-08-12 10:25刘亚芹杨振斌
标记免疫分析与临床 2019年7期
关键词:中和活动性结核病

刘亚芹,杨振斌

(聊城市传染病医院检验科,山东 聊城252000)

结核病是当今全球范围对人类最具威胁的感染性疾病之一,我国是全世界结核病负担最高的国家之一,发病率全球第三[1]。其中肺结核占结核病的比重最大,而控制肺结核病的有效手段就是实验室检查确诊病原,当前基层结核病实验室所采用的痰涂片敏感性低,痰培养周期长,4~8周,患者往往因待诊时间长而贻误病情,因此探索一种结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)高效的检测方法,快速准确诊断肺结核对控制结核病疫情具有重要意义。核酸恒温扩增检测(simultaneous amplification and testing,SAT)技术,能特异性的检测MTB的核糖体16SrRNA,通过莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV-RT)、T7 RNA多聚酶和优化探针技术共同来实现高效检测。本文通过对活动性肺结核疑似患者的SAT结果分析,来评价SAT检测在活动性肺结核患者中的应用价值。

材料和方法

1 材料

1.1 病例 对2015年7月1日至2017年6月30日来我院就诊的仅胸部X线检查显示与活动性肺结核相符的病变患者(活动性肺结核疑似患者)281例纳入分析。

1.2 检测项目 嘱患者留取5mL以上痰标本送检,标本被平分成3份同时进行中和离心法的MTB的培养、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测、SAT检测。AT法的

2 仪器与试剂

2.1 仪器 ①SAT:美国ABI7500实时荧光定量PCR仪,超声波处理器,高速离心机、混匀仪。②PCR:厦门安普利Genelight2400荧光PCR仪。③中和离心法培养:上海精宏GNP-9270恒温箱,上海舜宇FA1604型电子天平。

2.2 试剂 ①SAT:上海仁度公司试剂盒,含稀释液、检测液、酶(M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶)反应液等。②荧光PCR:厦门安普利MTB-DNA荧光定性试剂盒。③中和离心法培养:中性罗氏(L-J)培养基,鉴定用对硝基苯甲酸(PNB)培养基、噻吩-2-羧酸(TCH)培养基。

3 方法

3.1 培养和鉴定 ①中和离心法培养:取2mL痰入离心管,加1~2倍体积的N-乙酰-L半胱胺酸(N-acetyl L-cysteine,NALC)震荡10s,静置15min,加磷酸盐缓冲液40mL,3 000g离心20 min,沉渣两滴接种中性L-J。②鉴定:将培养物制成10-3mg/mL菌液,分别接种于L-J、PNB、TCH,并设标准菌株参比,37℃培养4周观察结果。

3.2 SAT检测 1mL痰加等量4%氢氧化钠(NaOH)震荡1min,静置15min,取1mL,13 000r/min离心5min,沉渣加50μL稀释液,超声功率300W 15min后,取2μL加30μL扩增检测液放恒温仪60℃10min,42℃5min,再加10μL SAT酶液,置ABI7500荧光PCR仪中反应。程序:荧光标记选择羟基荧光素,42℃l min,40个循环。

3.3 荧光PCR检测 1mL痰加等量4% NaOH处理20 min,12 000g离心5min,去上清加50μL处理液,96℃10min,12 000g离心5min,10μL入10×PCR扩增系统管,加20μL稀释液在Genelight 24000荧光PCR仪中扩增,程序:95℃,2min;75℃,15s;52℃,40s,40个循环。

4 结果判读说明

SAT:阳性(0<dt<35),阴性(dt=0或40)。dt为样本曲线与阈值交点的横坐标。阈值:阈值线为刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

PCR:阳性(0<ct<35),阴性(ct=0或40)。ct为样本曲线与阈值交点的横坐标。临界阳性ct大于强阳性对照的ct值,并小于38。

5 统计学处理

应用SPSS17.0软件进行数据处理,对两种方法在结核分枝杆菌检测中的比较采用配对四格表资料的χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

在281例经X射线检查显示与活动性肺结核疑似的患者中通过PNB、TCH鉴定出12例非结核分枝杆菌(non-tuberculousmycobacteria,NTM)。对这12例非结核分枝杆菌,中和离心法培养、SAT均检测为阴性,只有PCR检测为1例MTB阳性,后经基因测序鉴定为堪萨斯分枝杆菌(重做了PCR结果为阴性,考虑PCR的污染导致)。除去这12例NTM,其他269例患者,中和离心法培养、PCR、SAT的检测MTB阳性的例数分别为179、190、189,这三种检测方法阳性率最高的为PCR 70.6%,SAT为70.3%,与PCR非常接近,培养法的阳性率最低为66.5%。

以中和离心法培养为金标准,PCR与中和离心法培养的结果比较如下表1所示。

表1 PCR与中和离心法培养检测MTB结果的比较

根据表1的结果,经卡方分析,χ2=4.8,P=0.029,说明PCR与中和离心法培养两种方法在MTB检测中差异有统计学意义,PCR检测MTB的灵敏度为97.2%,特异性为82.2%。SAT检测与PCR检测MTB的结果比较如表2所示:

表2 SAT与PCR-DNA检测MTB的结果比较

以中和离心法培养为金标准,SAT检测与中和离心法培养检测MTB结果显示SAT检测MTB的灵敏度为98.3%,特异性为85.6%,经卡方分析,χ2=5.1,P=0.024,说明SAT与中和离心法培养在MTB检测中差异有统计学意义。

讨 论

结核病的诊断方法目前主要包括痰涂片镜检、培养法、免疫学、分子诊断技术等[2-3]。培养虽是检测MTB的金标准,但耗时长,中和离心法的培养需时3~8周,当前PCR在MTB的检测中应用较多,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加,从而更容易准确诊断肺结核[4]。已有研究报道,PCR检验在肺结核早期诊断中的应用价值较高且准确率较高[5-6]。PCR操作中仍需特别注意实验器材的污染问题,以免出现结果假阳性,本研究中PCR在检测12例NTM时也出现了这个情况。又因细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚,而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释放出DNA,以致造成PCR检测的假阴性。本研究中,在269例活动性肺结核疑似患者中,SAT检测MTB的灵敏度(98.3%)和特异性(85.6%)均高于PCR的特异性(97.2%)和灵敏度(82.2%)。SAT技术是第二代核酸检测技术,靶标RNA在RT酶作用下经过反转录合成一条带T7启动子的双链DNA,T7 RNA聚合酶以这条双链DNA为模板不断地合成RNA,新合成的RNA经过反转录过程又可以合成双链DNA,如此往复,以此达到扩增的目的。SAT检测结核菌核糖体RNA,核糖体RNA的含量在每个结核菌里面达到了2 000个拷贝,所以MTB-SAT检测的灵敏度非常高,SAT还利于疗效评估,患者在用药后,病原体死亡,RNA随之降解,所以RNA检测是活菌检测,检测结果直观反映结核菌在体内的存活状态,利于临床用药治疗效果的评估。RNA容易降解,也不易造成实验室的后续污染。综合来看,以16s RNA为靶标的SAT技术在不同程度上提高了检测结果的灵敏度和精确度,2~3 h即可获得检测报告[7-8]。而且SAT检测试验要求较荧光PCR扩增法低,恒温反应,耗时短,成本低,值得在MTB检测中推广应用。

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