尾型同源盒转录因子2和同源框蛋白A9在膀胱癌组织中的表达及临床意义*

林 晨,刘湘鄂,吴天玉,许 海

1.湖北省荆州市第三人民医院泌尿外科(荆州 434000);2.湖北省荆州市第三人民医院妇产科(荆州 434000); 3.湖北中医药大学黄家湖医院妇科(武汉 430070)

膀胱癌是泌尿系统中发生于膀胱黏膜上的恶性肿瘤，其发展是由多基因及多因素共同参与形成的复杂过程。目前，虽然膀胱癌在临床诊断及治疗上已取得新突破，但患者远期生存率仍较低，因此，应探讨一种新分子标记物，为膀胱癌患者临床治疗及预后提供一定参考依据。尾型同源盒转录因子2(Caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2)是一种特异性核转录因子，参与细胞发育、分化及增殖[1]。同源框蛋白A9(Homeobox protein A9，HOXA9)属于A簇同源盒基因(Homobox,HOX),对胚胎发育和细胞分化有重要调节作用[2]。已有研究报道[3-4]，CDX2和HOXA9表达与多种肿瘤的发生及预后关系密切，但两者表达与膀胱癌发病机制关系尚不明确。鉴于此，本研究通过免疫组织化学法(SP法)检测CDX2和HOXA9蛋白在76例膀胱癌及相应癌旁组织中的表达变化，并与83例正常膀胱黏膜组织中的表达比较，分析两者异常表达与膀胱癌发生及预后的关系。

资料和方法

1 一般资料 选取2013年9月至2015年9月收治的膀胱癌患者76例，均行手术治疗并留取膀胱癌组织标本及相应癌旁组织标本(≥4 cm)，术前均未行放疗或化疗。其中男45例、女31例，年龄45～76岁、平均年龄(56.23±10.02)岁。T1期20例、T2期17例、T3期26例、T4期13例，低分化19例、中分化16例、高分化41例，病变直径2～6 cm、平均病变直径(4.02±1.16) cm，有淋巴结转移34例、无淋巴结转移42例。另选取同期因膀胱炎进行治疗的83例正常膀胱黏膜组织标本，其中男37例、女46例，年龄45～77岁、平均年龄(56.71±10.15)岁。所有组织标本均用30 g/L的甲醛溶液固定，经石蜡包埋后切片(厚4 μm)。本研究经医院伦理委员会审批通过。入选标准：所有患者均知情同意；配合研究；肝、肾及心功能正常；具备随访条件。排除标准：术前接受过激素类药物治疗；妊娠或哺乳期女性；有沟通障碍者；有其他恶性肿瘤。上述基本资料组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2 研究方法

2.1 CDX2和HOXA9蛋白检测：采用SP法检测CDX2和HOXA9蛋白表达。小鼠抗人CDX2单克隆抗体购自上海信裕生物科技有限公司，小鼠抗人HOXA9多克隆抗体购自上海煊翎生物科技有限公司。严格按SP法说明书进行操作。由三位高年资病理医师分别阅片，共同进行结果判定，每张组织切片随机选择5个染色均匀的高倍视野(×400)，统计视野内阳性细胞染色情况。阴性：无阳性细胞染色，记为(-)；弱阳性：阳性细胞染色<25%，记为(+)；中阳性：25%≤阳性细胞染色≤50%，记为()；强阳性：阳性细胞染色>50%，记为()。以阴性和弱阳性为CDX2和HOXA9蛋白低表达，中阳性和强阳性为CDX2和HOXA9蛋白高表达。

2.2 随访：76例膀胱癌患者出院后每月电话随访1次，共随访3年，截止日期为2018年10月31日。记录膀胱癌患者生存人数和死亡人数，随访结束后统计总生存率(OS)。

3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件处理数据，计数资料用[例(%)]描述，行χ2检验；用Spearman检验对膀胱癌患者CDX2、HOXA9蛋白表达进行相关性分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，行Log-rank检验；COX回归分析影响膀胱癌患者预后的因素；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CDX2和HOXA9蛋白在不同组织中表达 见表1。膀胱癌组织CDX2和HOXA9蛋白阳性率明显高于正常膀胱黏膜组织和癌旁组织(P<0.05)，癌旁组织CDX2和HOXA9蛋白阳性率与正常膀胱黏膜组织，比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 CDX2和HOXA9蛋白在不同组织中表达

注：与正常膀胱黏膜组织比较，*P<0.05；与癌旁组织比较，△P<0.05

2 CDX2和HOXA9蛋白表达与膀胱癌患者临床特征关系 见表2。CDX2蛋白表达与膀胱癌患者年龄、性别及病变直径无关(P>0.05)，与病理分期、分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05)；HOXA9蛋白表达与膀胱癌患者年龄、性别无关(P>0.05)，与病理分期、分化程度、病变直径及淋巴结转移有关(P<0.05)。

表2 CDX2和HOXA9蛋白表达与膀胱癌患者临床特征关系[例(%)]

3 膀胱癌患者CDX2、HOXA9蛋白表达的相关性分析 见表3。

表3 膀胱癌患者CDX2、HOXA9蛋白表达的相关性分析

膀胱癌患者CDX2蛋白表达与HOXA9蛋白表达呈正相关(r=0.401，P<0.05)。

4 CDX2和HOXA9蛋白表达与膀胱癌患者OS关系 76例膀胱癌患者有34例死亡，42例存活，3年OS为55.26%。生存分析结果显示，CDX2蛋白低表达患者OS(67.35%)明显高于高表达患者OS(33.33%)(χ2=8.998，P=0.003)；HOXA9蛋白低表达患者OS(70.00%)显著高于高表达患者OS(38.89%)(χ2=7.099，P=0.008)(图1)。

5 影响膀胱癌患者预后的危险因素分析 见表4。单因素分析显示，病理分期、分化程度、病变直径、淋巴结转移、CDX2及HOXA9蛋白表达均是影响膀胱癌患者预后的危险因子(P<0.05)。多因素分析显示，病理分期、分化程度、淋巴结转移、CDX2及HOXA9蛋白表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。

图1 CDX2和HOXA9蛋白表达与膀胱癌患者OS关系

变量单因素分析HR值95%置信区间P值多因素分析HR值95%置信区间P值年龄(<56岁、≥56岁)2.4250.852～5.1270.2612.7540.772～8.1540.325性别(男、女)2.8810.399～2.4540.3343.0530.674～3.4670.099病理分期(T1～T2 、T3～T4)1.9891.328～5.0310.0022.3611.325～4.2060.001分化程度(中、低分化与高分化)2.3151.569～9.5460.0002.1581.227～3.7970.000病变直径(<4 cm、≥4 cm)2.6261.902～7.3120.0112.5520.827～3.1660.184淋巴结转移(有、无)2.4511.243～6.1520.0021.7511.035～2.9640.005CDX2蛋白表达(低表达、高表达)3.1541.625～5.0330.0003.2861.662～6.4950.003HOXA9蛋白表达(低表达、高表达)3.0071.227～3.5720.0032.9481.503～5.7810.002

讨 论

近年来，膀胱癌患者在免疫治疗及放、化疗上有一定进展，但患者预后效果差[5]。由于现有肿瘤分子标记物不能充分反映膀胱癌生物学特征，膀胱癌患者术后复发率高，因此，应进一步寻找新肿瘤分子标记物，以期为膀胱癌诊断、治疗及术后复发提供依据。研究发现[6-7]， CDX2、HOXA9表达参与结肠癌、肺癌等发展进程，有望作为抗癌治疗的靶点和预后预测因子。

CDX2属于尾型同源基因家族(Caudal-related homeobox，CDX)，位于人染色体13 q12-13，包含2个内含子和3个外显子。CDX2通过螺旋-环-螺旋方式与DNA结合，并以转录因子形式反映DNA表达[8]。CDX2在胚胎细胞发育、分化中起关键作用，在多种肿瘤侵袭和转移中扮演着重要角色[9-10]。有研究发现[11]，在胃癌中，高分化肿瘤组织CDX2蛋白表达高于低分化组织。何娟等[12]研究发现，CDX2蛋白在原发性卵巢癌和转移性卵巢癌中均高表达，是检测卵巢癌的重要指标之一。孙丹等[13]研究发现，胃癌组织中CDX2蛋白表达阳性率显著高于正常胃黏膜组织，与肠型胃癌发生密切相关。本研究通过检测不同组织中CDX2蛋白表达，发现其表达在膀胱癌组织中最高、癌旁组织次之、正常膀胱黏膜组织最低，与孙丹等[13]研究结果相似，此结果提示CDX2表达上调可促进膀胱癌发展，CDX2表达上调是膀胱癌发生发展的机制之一。为进一步明确CDX2蛋白表达与膀胱癌发生发展关系，本研究对其与膀胱癌临床特征关系进行分析，发现CDX2蛋白表达与膀胱癌患者病理分期、分化程度及淋巴结转移有关，与上述研究相似[11]，此结果提示CDX2表达变化可能与膀胱癌病情严重程度有关。

同源盒基因(HOX)最初发现于果蝇体内，是一组具有高度保守性的转录因子。HOXA9是HOX中重要转录调节因子，位于人染色体7p15-p14，转录物为外显子CD和外显子Ⅱ。HOXA9蛋白具有典型的螺旋-转角-螺旋结构，在各种胚胎和成熟组织中均有表达[14]。HOXA9蛋白可作为多种肿瘤的诊断标志物，其异常表达与肿瘤的侵袭、转移及预后关系密切[15-16]。李琳等[17]对急性髓系白血病研究，发现HOXA9mRNA高表达，与患者疗效、预后有一定关系。谢忻琰等[18]研究发现，HOXA9mRNA在骨髓增生异常综合征中高表达，与临床分期及分化程度关系密切。还有研究发现[19]，在卵巢癌细胞中HOXA9表达上调，与卵巢癌患者不良预后有关。本研究结果显示，HOXA9蛋白在不同组织中表达高低依次为：膀胱癌组织、癌旁组织、正常膀胱黏膜组织，且HOXA9蛋白表达与膀胱癌组织病理分期、分化程度、病变直径及淋巴结转移有关，与上述研究结果相似[17-19]，推测HOXA9蛋白表达上调可能促进肿瘤生长和侵袭，为临床防治膀胱癌发生发展提供新思路。本研究相关性分析显示膀胱癌组织CDX2蛋白表达与HOXA9蛋白表达呈正相关，推测两者表达可能共同参与膀胱癌发展进程，为其防治提供新途径。本研究进一步探讨CDX2、HOXA9蛋白表达对膀胱癌患者远期生存率影响，结果显示膀胱癌患者3年OS为55.26%，CDX2、HOXA9蛋白低表达患者OS明显高于高表达患者，且病理分期、分化程度、淋巴结转移、CDX2及HOXA9蛋白表达是影响膀胱癌患者预后的危险因子，与上述研究相似[17-19]，提示CDX2和HOXA9蛋白表达与膀胱癌患者远期生存率有关，推测CDX2和HOXA9蛋白表达可作为判断膀胱癌患者预后的生物指标。

本研究结果表明膀胱癌组织中CDX2和HOXA9蛋白高表达，两者可能相互作用参与膀胱癌病情进展，在临床防治和预后判断上有一定意义。本研究中CDX2、HOXA9蛋白相互作用对膀胱癌发展的具体机制研究较浅，接下来应针对此问题更深入地研究。