软骨下骨局部抑制Th17细胞介导的骨吸收对骨关节炎发病及进展作用的实验研究*

许婷 陈志刚 覃汉俊 吴航天 余斌 崔壮** 胡岩君**

（1.南方医科大学南方医院呼吸睡眠中心，广州 510515；2.广州医科大学第五附属医院骨科，广州 510700；3.南方医科大学南方医院创伤骨科，广州 510515）

骨关节炎（osteoarthritis,OA）发病过程中，软骨下骨和关节软骨相互作用，形成一个功能体[1-7]。OA的特征是关节软骨的退行性变、软骨下骨的硬化、关节周围骨刺的形成[8-11]。目前针对OA 没有特别有效的治疗方法，关节置换是骨关节炎晚期患者必须面临的选择[12]。OA发病机制仍不清楚。近期越来越多的证据表明，在OA发病过程中，软骨下骨为关节软骨提供力学支撑。软骨下骨异常的骨吸收能够改变关节软骨正常的力学环境，从而诱导关节软骨发生退行性病变，最终导致OA[13]。Th17 细胞是一种促进骨吸收的辅助T细胞，能通过分泌IL17诱导核因子κB受体活化子配体的表达，进而促进破骨细胞的分化[14-16]。软骨下骨过度骨吸收，使沉积于软骨下骨骨基质中的成骨和破骨偶联因子过度释放，进而诱导非偶联的骨重塑，即成骨不在骨吸收部位，导致软骨下骨的异位成骨，改变关节软骨的应力[13]。常山酮是从中药常山中提取的一种喹唑啉酮生物碱，早在2000多年前常山就被用作抗疟疾药物[17]。近期研究表明常山酮能够抑制Th17细胞分化[18]。前期研究发现，全身给予常山酮能够通过抑制Th17 细胞来抑制OA 的进展[19]。基于理论：软骨下骨异位骨化在OA发病过程中发挥重要作用；Th17细胞介导的骨吸收促进软骨下骨异位成骨发生。提出假设：局部给予常山酮抑制软骨下骨Th17细胞能抑制OA发病及进展。但目前软骨下骨局部给药仍是一个难点和挑战。本研究提出将渗透性输液泵置入软骨下骨，以实现软骨下骨定量、持续和稳定的局部给药方式。本研究旨在探讨通过渗透性输液泵局部给药常山酮，是否能够抑制软骨下骨Th17细胞介导的骨吸收进而抑制OA进展，以及潜在机制，为OA的预防和临床治疗提供新的技术思路和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物及OA模型建立

从南方医科大学动物实验中心购买3月龄SD大鼠30 只，分3 组：假手术组（10 只）、OA 组（10 只）、常山酮组（10 只）。OA 组和常山酮组骨关节炎模型通过切断膝关节前交叉韧带诱导。目前在OA研究中，前交叉韧带离断（anterior cruciate ligament transection,ACLT)模型是常用并被广泛认可的模型。大鼠乙醚吸入麻醉后，在显微镜下切开皮肤及皮下组织，暴露髌骨，髌骨内侧缘分离髌内侧组织，将髌骨外翻，暴露膝关节内前交叉韧带。OA 组和常山酮组显微剪剪断前交叉韧带，而后予关节囊和皮肤缝合；假手术组不剪断前交叉韧带，关节囊切开后便予皮肤缝合。术后大鼠放在电暖垫上复苏。

1.2 软骨下骨渗透性输液泵置入

大鼠造模后即刻置入渗透性输液泵，沿手术造模切口，分离膝外侧皮下组织。紧贴髌骨外侧缘及胫骨平台前下方剥离胫骨前肌群附着点。为避免直接将渗透性输液泵插入软骨下骨导致的输液泵针管堵塞，在插入输液泵前首先用一个1 ml注射器针头由胫骨平台前下方斜向内上方插入；采用多模式小动物活体成像系统（FX Pro，Bruker）拍摄小鼠膝关节侧位片，确认针头进入软骨下骨深度。本研究以针头刚好进入软骨下骨为准，以免损伤软骨下骨骨质结构，对实验产生影响。拔出针头，测量针头进入深度。将渗透性输液泵（Alzet model 1004，0.11 μl/h，28 d）沿预先针头插入的通道进入，插入深度同针头测量深度。然后将掀起的胫骨前肌覆盖于针尾，缝合固定。常山酮给药28 d，期间泵入软骨下骨常山酮量为0.2 μg（配制溶液浓度1 μg/370 μl）。大鼠实验过程中未出现死亡。大鼠术后2个月予安乐死。取材检测。

1.3 micro-CT 扫描

取大鼠膝关节标本去除膝周肌肉软组织，固定于70%酒精过夜。采用高分辨率的micro-CT（Sky-Scan 1172）对标本进行扫描，同时使用图像重建软件（NRecon v1.6)进行扫描图片重建。标本分析采用数据分析软件（CTAn v1.9）和三维可视软件（μ CTVol v2.0）。扫描电压设置为50 kVp、电流200 μA、每像素5.8 μm 分辨率，进行分析的三维图片为大鼠胫骨软骨下骨矢状位片。定义兴趣区域为整个胫骨软骨下骨内侧部分。分析指标包括：软骨下骨骨体积与组织体积比值（BV/TV）、松质骨模式因子（Tb.Pf）、松质骨数量（Tb.N）及软骨下骨板厚度（SBP.Th）。

1.4 免疫荧光和免疫组织化学染色

大鼠膝关节标本固定于4%福尔马林48 h，10%乙二胺四乙酸（PH 7.4）脱钙4 周。分别使用石蜡和冰冻包埋。石蜡包埋用于免疫组织化学染色。冰冻包埋用于免疫荧光染色。标本切片为内侧纵行切片，切片厚度为4 μm。免疫组织化学使用苏木精进行复染。免疫荧光染色将标本孵于一抗后，4℃过夜，次日加带有荧光标记的二抗，常温下1 h，同时避光。使用共聚焦显微镜对染色进行观察和摄片（Olympus DP71）。数据计数和定量分析采用双盲方式，分析软件为ImageJ（ImageJ 1.51j8）。对整个软骨下骨的阳性细胞进行计数，同时各组每个大鼠观察连续5张染色片取平均数。采用文献提供的国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International,OARSI）评分方法对关节软骨进行评分[20]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。数据以均值±标准差表示。先进行方差齐性和正态性检验，再使用单因素方差分析进行组间比较，方差齐用LSD检验，不齐用DunnettT3检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨下骨给予常山酮抑制ACLT大鼠关节软骨退行性变

依据实验方法构建ACLT OA模型及在大鼠膝关节软骨下骨置入渗透性输液泵（图1）。关节软骨番红固绿染色显示不同组别关节软骨发生变化（图2）。OA 组关节软骨出现明显退行性病变，而软骨下骨给予常山酮抑制了关节软骨的退行性变。同时发现关节软骨的破坏由深层到浅层，图2B箭头示软骨下骨深层首先开始软骨骨化，而表面关节软骨仍完整。OARSI评分示OA组较假手术组显著升高（P＜0.05)；软骨下骨给予常山酮显著降低软骨OARSI评分（P＜0.05)。

2.2 软骨下骨给予常山酮抑制软骨下骨Th17细胞介导的骨吸收

进一步探讨局部给予常山酮抑制软骨退行性变的机制。ACLT大鼠软骨下骨Th17细胞明显升高，局部给予常山酮抑制了Th17细胞的增加（P＜0.05，图3、4）。Th17细胞能够通过分泌IL17促进破骨细胞的分化[5]。本实验结果与之类似，OA组TRAP+破骨细胞较假手术组显著升高（P＜0.05)；而软骨下骨给予常山酮显著降低了软骨下骨TRAP+破骨细胞（P＜0.05，图5）。

2.3 软骨下骨给予常山酮维持软骨下骨正常的骨显微结构

图1 软骨下骨置入渗透性输液泵

图2 三组关节软骨变化情况

通过micro-CT扫描确认软骨下骨骨显微结构的变化情况。分析指标包括：软骨下骨骨体积与组织体积比值（BV/TV）、松质骨模式因子（Tb.Pf）、松质骨数量（Tb.N）及软骨下骨板厚度（SBP.Th）。与假手术组比较，ACLT升高了软骨下骨Tb.Pf（P＜0.05），同时降低了BV/TV（P＜0.05）、SBP.Th（P＜0.05）及Tb.N（P＜0.05）。渗透性输液泵局部给予常山酮逆转了软骨下骨骨显微结构变化，使其类似假手术组（图6、7）。该结果表明软骨下骨局部给予常山酮能够通过抑制Th17 细胞介导的骨吸收，维持软骨下骨正常的骨显微结构，进而保护关节软骨，抑制OA进展。

3 讨论

图3 三组软骨下骨Th17细胞表达定量分析

图4 三组软骨下骨Th17细胞表达情况

图5 不同组间软骨下骨TRAP+破骨细胞表达情况

越来越多研究者开始重视软骨下骨病变在OA发病中的作用。既往研究[21-25]显示，在OA 发病过程中，软骨下骨的病变早于关节软骨。OA 发病过程中因各种原因导致软骨下骨骨吸收，引起软骨下骨非偶联骨重塑，进而引起关节软骨应力改变导致退行性变。近期研究[26,27]表明，使用抗骨质疏松药物能够抑制OA 进展。软骨下骨与关节软骨是一个相互作用的功能体[1]，软骨下骨为关节软骨提供力学支撑。软骨下骨异常的骨吸收诱导的非偶联骨重塑导致软骨下骨异位骨岛的形成，引起关节软骨应力改变[13]。关节软骨在异常应力刺激下，导致软骨细胞生物力学发生改变。软骨细胞合成代谢下降，分解代谢增加，如基质金属蛋白酶等分泌增加，促进了关节软骨的基质的分解，最终导致关节软骨退行性病变。因此局部抑制软骨下骨骨显微结构的改变，可能有保护关节软骨，抑制OA进展的作用。

本研究发现，通过渗透性输液泵在软骨下骨予以局部给予常山酮，抑制了关节软骨的退行性变。通过番红固绿染色发现，ACLT导致关节软骨OARSI 评分显著升高，而软骨下骨给予常山酮显著降低了OARSI评分。关节软骨在膝关节位于骨端覆盖于软骨下骨上。关节软骨由软骨细胞、糖蛋白及Ⅱ型胶原纤维等构成。关节软骨中无血管等组织，糖蛋白在关节软骨中发挥着分子海绵的作用，控制着关节软骨水分和营养物质的摄入和排出[28]。Ⅱ型胶原纤维为关节软骨提供支架，维持着关节软骨的结构完整。OA 发病过程中，由于关节软骨在异常应力刺激下导致分解代谢增加，促进了Ⅱ型胶原纤维及糖蛋白的裂解。同时发现软骨破坏由深层向浅层进展，深层关节软骨糖蛋白表达减少，而表层关节软骨仍完整，进一步表明关节软骨的退行性变由软骨下骨诱导。

图6 三组软骨下骨骨显微结构

软骨下骨Th17细胞调控软骨下骨骨吸收[14]。既往研究[29]表明，Th17细胞能够调控破骨细胞分化进而促进骨吸收。Th17 细胞通过分泌IL17，促进骨基质细胞分泌RANKL 表达，进而促进破骨细胞的分化[14,30]。前期研究[19]表明，全身给予常山酮能够抑制软骨下骨Th17 细胞。但全身给药有一定局限性，如不可预知的副作用，会限制在临床中的应用。同时软骨下骨局部给药抑制Th17细胞介导的破骨细胞分化目前仍不清楚。本研究提出了局部软骨下骨给药的新方法，即将渗透性输液泵置入软骨下骨，以实现软骨下骨定量、持续和稳定的局部给药。本研究发现，通过渗透性输液泵在软骨下骨局部给予常山酮，能够抑制软骨下骨Th17 细胞介导的破骨细胞分化，TRAP+破骨细胞表达明显降低。

抑制Th17细胞介导的骨吸收可以维持软骨下骨骨纤维结构。本研究发现，在OA 发病过程中，软骨下骨BV/TV、Tb.N 及SBP.Th 显著降低，Tb.Pf 显著升高。Tb.Pf 为软骨下骨模式因子，反映的是软骨下骨骨显微结构及骨连接性破坏情况。因而Tb.Pf 值升高，表明软骨下骨骨显微结构破坏加重，即非偶联骨重塑占据主导[13]。非偶联骨重塑导致软骨下骨骨形成不在骨吸收的部位，从而导致骨吸收的部位出现骨质疏松，而非成骨部分出现成骨如骨刺形成。因而最终导致软骨下骨骨体积BV降低，而组织体积TV增大，即BV/TV 降低；软骨下骨骨小梁及软骨下骨生长板SBP 进行着过度的骨吸收，同时成骨非偶联，因而导致骨小梁数量Tb.N降低及SBP.Th变薄。而软骨下骨给予常山酮能够维持软骨下骨骨显微结构，从而维持了关节软骨的正常受力。

图7 三组软骨下骨骨显微结构定量分析

本研究为了避免直接将渗透性输液泵插入软骨下骨导致的输液泵针管堵塞，在插入输液泵前首先用一个1 ml注射器针头由胫骨平台前下方斜向内上方插入，再沿预先针头插入的通道插入渗透性输液泵。本研究以针头刚好进入软骨下骨为准，以最大程度避免损伤软骨下骨骨质结构。同时在常山酮组通过输液泵给药常山酮的同时，也在OA组通过输液泵给予常山酮溶剂。研究结果表明软骨下骨给予常山酮抑制了OA组软骨下骨及关节软骨的相应变化。

由于OA发病机制目前仍不完全清楚，OA目前的治疗目的是缓解疼痛，延缓疾病进展[31]。早期软骨下骨给药抑制软骨下骨异常骨重塑而导致的关节软骨退行性变，为OA患者的治疗提供新的视点。临床可通过MRI筛查非炎症性关节疼痛患者软骨下骨病灶，进而在临床实时透视设备的辅助下，精准定点取出病灶，同时将渗透性给药泵置入并固定，或置入载药可吸收复合体填充骨缺损。本研究亦有一定局限性。软骨下骨给药更适用于OA早期患者，因其抑制早期软骨下骨异常骨重塑。但目前医疗环境下，骨关节炎早期诊断仍然存在诸多问题。在我国很多OA患者一般在疾病晚期关节软骨破坏严重时才到医疗机构就诊，因而也影响OA保守治疗的疗效。因此确定早期OA诊断标准及患者健康教育普及也尤为重要。但本研究仍为OA的预防及临床治疗提供新的思路和理论支撑。