机械生长因子对压力性尿失禁患者肛提肌修复作用的研究

董润楠，宋志英，王文渊

压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指当腹压增加，如大笑、咳嗽、打喷嚏、行走、搬重物等的时候，在膀胱逼尿肌未收缩的情况下，患者出现尿液漏出且不能自行控制，严重影响患者的正常生活、工作、社交和两性关系，威胁妇女躯体、心理和社会等方面的健康。基于盆底整体理论和吊床理论，SUI的发生与肛提肌的损伤密切相关。机械生长因子（mechano growth factor，MGF）是骨骼肌损伤后局部微环境中表达迅速上调的一种生长因子，发挥修复再生作用的具体机制不清。本研究通过检测女性SUI患者及直肠癌根治术患者肛提肌成肌细胞的存活率及层黏连蛋白（Laminin）、肌营养不良蛋白（Dystrophin）的表达情况，初步探索MGF对SUI治疗作用的具体机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂及仪器 MGF购自上海近岸蛋白质科技有限公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自上海吉尔生化有限公司，胎牛血清（FBS）购自上海舜冉生物科技有限公司，DMEM细胞培养基购自上海拜力生物科技有限公司，兔抗横纹肌辅肌动蛋白抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，FITC标记的羊抗兔IgG抗体、总RNA提取试剂盒、超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。倒置三目生物显微镜购自上海领成生物科技有限公司，CO2培养箱购自上海皓庄仪器有限公司，荧光显微镜、CFX Connect实时定量聚合酶链反应（PCR）仪购自上海伯乐生命医学产品有限公司，离心机购自常州中捷实验仪器制造有限公司，台式空气恒温振荡器购自太仓市华美生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 实验取材 选择2016—2017年于山西省妇幼保健院妇产科诊断为SUI并行盆底修复手术的患者1例，术中钳夹3～4块5 mm×5 mm×5 mm肛提肌组织，液氮罐中保存。选择同期于山西省肿瘤医院诊断为低位直肠癌并行经腹会阴联合根治术的患者1例，同法取得肛提肌活检标本。

1.2.2 肛提肌成肌细胞分离培养 将肛提肌活检标本剪成1 mm3的碎块，Hanks液冲洗3次。往碎块中加入按1∶1混合的胶原酶（0.1%）和胰蛋白酶（0.25%），消化2次（37℃，30 min/次）。取第2次消化所得的细胞悬液，加入含10%FBS的DMEM高糖培养基终止消化。移入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。取细胞沉淀，再加入含10%FBS的DMEM高糖培养基，培养瓶静置（37℃，30 min）。取细胞悬液，计数，按1×104个/mL的密度接种至培养瓶，培养箱培养（37℃，5%CO2，饱和湿度）。显微镜下观察细胞形态及生长情况，当细胞融合度达到90%以上时再消化传代。

1.2.3 肛提肌成肌细胞鉴定 磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗培养皿3次（3 min/次）。4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS浸洗培养皿 3次（3 min/次）。PBS配制的 Triton X-100（0.5%）室温通透20 min。PBS浸洗培养皿3次（5 min/次），移液枪吸干PBS，在培养皿内滴加牛血清白蛋白溶液（5%）封闭30 min（37℃）。移液枪吸干封闭液，不洗。在培养皿内滴加足够量的稀释好的一抗：兔抗横纹肌辅肌动蛋白抗体（1∶250），4℃孵育过夜。PBS浸洗培养皿3次（3 min/次），移液枪吸干多余液体，在培养皿内滴加稀释好的荧光二抗：FITC标记的羊抗兔IgG抗体（1∶200），37℃孵育 30 min。PBS浸洗培养皿 3次（3 min/次）。在培养皿内滴加DAPI避光孵育5 min。对标本进行染核，PBS洗去多余的DAPI，20%甘油封闭培养皿。在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.4 MTT法检测肛提肌成肌细胞增殖活力 取SUI患者的第3代肛提肌成肌细胞，分为4组：SUI组（0 ng/mL）加1 μL生理盐水，MGF组（50 ng/mL）加 1 μL浓度为 50 ng/mL的MGF，MGF组（100 ng/mL）加 1 μL浓度为 100 ng/mL 的 MGF，MGF组（150 ng/mL）加 1 μL浓度为 150 ng/mL的 MGF，每组设6个复孔。将细胞密度重悬为1×104个/mL（血细胞计数板计数），加至96孔板（每孔100 μL）继续培养。显微镜下观察细胞生长情况，当细胞铺满70%～80%时，更换无血清培养液，孵育 24 h。分别于干预后 24 h、48 h、72 h，每孔加 50 μL MTT试剂，4 h后吸出上清，加150 μL二甲基亚砜，振荡器振荡10 min，在550 nm波长处测定各孔吸光度（OD）值。计算公式：细胞存活率（%）=[OD（MGF组）-OD（空白）]/[OD（SUI组）-OD（空白）]×100%。

1.2.5 反转录PCR（RT-PCR）法检测肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA的表达 于SUI患者的第3代肛提肌成肌细胞孵育72 h后，采用RT-PCR法测定SUI组（0 ng/mL）、MGF 组（150 ng/mL）Laminin、Dystrophin mRNA 的含量，取直肠癌根治术患者的第3代肛提肌成肌细胞作为对照组。根据说明书用总RNA提取试剂盒、超纯RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒将RNA通过逆转录合成cDNA。将Laminin上游引物设计为5′-CTCTGGGGAACTGGAGAATC-3′，下游引物设计为 5′-ACTTGGGCGTGAACTTGTAG-3′。Dystrophin上游引物设计为 5′-TTTGGTGGGAAGAAGTAGAGG-3′，下游引物设计为 5′-GTTGACATTGTTCAGGGCAT-3′。内参GAPDH上游引物设计为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游引物设计为 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。这三者产物长度分别为72 bp、230 bp和 224 bp。PCR 反应体系 25 μL：95℃ 10 min预变性；95℃10 s变性；57℃30 s退火；72℃30 s延伸，循环40次。实验重复3次。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt比较法算出各组肛提肌成肌细胞中Laminin、Dystrophin mRNA的相对表达量。在P＜0.05 的情况下，如果 2-ΔΔCt＜1，说明目的基因在实验组中表达下调；如果 2-ΔΔCt＞1，说明目的基因表达上调；否则表达无差异。

1.3 统计学方法 用SPSS 21.0统计软件进行分析。定量资料以均数±标准差（±s）表示；MGF 浓度、MGF 作用时间、肛提肌成肌细胞存活率的数据资料采用析因设计的方差分析；肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA表达的数据资料采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肛提肌成肌细胞电镜观察及鉴定 与对照组相比，SUI组（0 ng/mL）第3代肛提肌成肌细胞生长密度较小，细胞形态较皱缩，光泽度较弱。MGF组（50 ng/mL）、MGF 组（100 ng/mL）、MGF 组（150 ng/mL）的细胞生长密度渐增大，细胞形态渐饱满，结构渐完整，光泽度渐强。见图1。对照组和SUI组（0 ng/mL）第3代肛提肌成肌细胞均表达骨骼肌细胞标志性蛋白——横纹肌肌动蛋白。见图2（见后插一）。

图1 各组第3代肛提肌成肌细胞电镜观察

2.2 不同浓度、不同干预时间肛提肌成肌细胞存活率比较 不同浓度MGF促进肛提肌成肌细胞增殖的效果不同（F浓度=65.055，P浓度=0.000）；不同 MGF作用时间促进肛提肌成肌细胞增殖的效果不同（F时间=24.586，P时间=0.000）；MGF 浓度和 MGF 作用时间两因素间存在交互作用（F时间×浓度=3.222，P时间×浓度=0.008），当MGF浓度为150 ng/mL和MGF作用时间为72 h时，肛提肌成肌细胞存活率最高。见表1。

2.3 各组肛提肌成肌细胞 Laminin、Dystrophin mRNA的表达量比较 与对照组比较，SUI组（0ng/mL）肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA的表达量降低（P＜0.05）；与 SUI组（0 ng/mL）比较，MGF 组（150 ng/mL）肛提肌成肌细胞 Laminin、Dystrophin mRNA的表达量增加（P＜0.05）。见表2。

表1 不同浓度、不同干预时间肛提肌成肌细胞存活率比较（±s，%）

表1 不同浓度、不同干预时间肛提肌成肌细胞存活率比较（±s，%）

注：F 浓度=65.055，P 浓度=0.000；F 时间=24.586，P 时间=0.000；F 时间×浓度=3.222，P 时间×浓度=0.008。

MGF浓度 n 24 h 48 h 72 h SUI组（0 ng/mL） 6 100 100 100 MGF 组（50 ng/mL） 6 104.607±4.931 106.218±2.356 115.722±4.577 MGF 组（100 ng/mL） 6 108.316±4.282 110.669±3.184 115.946±4.791 MGF 组（150 ng/mL） 6 112.159±4.127 114.245±3.026 120.228±4.046

表2 各组肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA的表达量比较（±s，2-ΔΔCt值）

表2 各组肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin mRNA的表达量比较（±s，2-ΔΔCt值）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b 与 SUI组比较，P＜0.05。

组别 n Laminin mRNA Dystrophin mRNA对照组 3 1.028±0.029 0.964±0.137 SUI组（0 ng/mL） 3 0.404±0.050a 0.505±0.177a MGF 组（150 ng/mL） 3 0.871±0.110b 0.846±0.173b F 32.789 5.134 P 0.000 0.029

3 讨论

中国成年女性SUI、急迫性尿失禁和混合性尿失禁相应的比例分布分别为61%、8%和31%，患病率分别为18.9%、2.6%和9.4%，在50～59岁年龄段，SUI的患病率最高，为28.0%[1]。SUI患者不仅表现为腹压增加下不自主溢尿，还可出现性交不适、尿路感染、外阴湿疹等，同时伴随羞耻、尴尬、自卑、抑郁等情绪，导致患者减少外出工作、生活及社交，并减少性行为。Lim等[2]招募年龄≥21岁、处于性活跃期的女性310例（SUI患者134例，无SUI健康受试者176例）及其伴侣进入研究，女性完成Golombok Rust性满意度量表（GRISS）和国际尿失禁咨询委员会-下尿路症状-生活质量问卷（ICIQ-Lutsqol），伴侣仅完成GRISS量表，结果发现与无SUI健康受试者相比，SUI患者总体性功能、性交频率、满意度均较低（P＜0.001），生活质量也较差；与无SUI健康受试者的伴侣相比，SUI患者的伴侣在勃起功能障碍方面存在更多问题。除此之外，SUI的经济成本也很高，大多数原因在于患者自付的可吸收垫、洗衣等尿失禁常规护理所需资源的费用。且每人每年在SUI上的花费差异很大，大约在50～1 000美元之间，SUI程度越严重，患者经济负担越重[3]。

目前，非手术和手术方式均已用于女性SUI治疗。非手术方式包括认知行为疗法、注射疗法、物理治疗、西药治疗和中医治疗等[4-6]。手术方式包括经阴道无张力尿道中段悬吊术（TVT）、经闭孔（由外向内）无张力尿道中段悬吊术（TOT）、经闭孔（由内向外）无张力尿道中段悬吊术（TVT-O）、单切口尿道中段吊带术和Cooper韧带悬吊术等[7-10]。手术方式治疗女性SUI有其适应证，且患者需承担手术治疗所带来的创伤、风险、费用和并发症等问题[11-12]。近年来，非手术方式治疗女性轻、中度SUI得到了临床工作者的广泛研究，它们或微创，或无创，在风险、费用和并发症等方面的问题较少，同时又能帮助患者改善SUI症状。

迄今为止，已有多种理论和学说用于解释SUI的发病机制。在盆底整体理论和吊床理论这两种理论中，均强调了尿控机制中肛提肌的重要作用[13]。与其他大多数骨骼肌不同，肛提肌除了排尿、排便和Valsalva动作外，能一直保持休整状态，具有在腹压突然增加的情况下快速收缩的能力，从而最大限度地减少尿失禁和盆腔器官脱垂的风险，矛盾的是，肛提肌必须在分娩期间延伸甚至超出其限度，以允许婴儿通过，但其在分娩后收缩以恢复正常功能[14]。SUI与肛提肌的损伤密切相关，而肛提肌作为骨骼肌，是有丝分裂后的组织，一旦形成，细胞分裂就不会发生在肌纤维内，在产后诱导的肌肉生长过程中，所需的增殖细胞（成肌细胞）来源于肛提肌干（卫星）细胞池，代表肛提肌自我修复的生物学储备[15]。

MGF是胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）可变剪接的产物，IGF-1 mRNA 前体3′端的选择性剪接编码3种不同的IGF-1前体蛋白：IGF-1Ea、IGF-1Eb 和 IGF-1Ec（信号肽+IGF-1成熟肽+E结构域），这3种蛋白质都含有成熟的IGF-1肽，并在E结构域的氨基端部分共享一个共同的16个氨基酸序列，由于E结构域羧基端的氨基酸序列不同，导致IGF-1这3种剪接变体具有不同的作用[16-19]。机械信号作用于啮齿类动物和人类体内除了肝脏以外的其他组织，以自分泌或旁分泌的形式产生啮齿类动物的IGF-1Eb和人类的IGF-1Ec，命名为MGF。大量研究报道，早在肌肉损伤后2～24 h，MGF表达就会上调，通过其高度带正电荷的E结构域，迅速激活肌卫星细胞，促进有丝分裂从而促进成肌细胞增殖，发挥骨骼肌损伤后修复作用[20-22]。吴国梁等[23]以SD大鼠的腓肠肌为研究对象，通过动物实验证实了MGF的促增殖作用。黄艳等[24]对产后SUI模型大鼠施以MGFE肽注射治疗，发现治疗后SD大鼠的最大膀胱容量和漏尿点压力均提高，尿道括约肌和肛提肌组织的肌纤维再生也较治疗前更丰富。王聪娜等[25]发现外源性MGF E肽可促进产后SUI模型大鼠内源性MGF的表达。

Laminin是由α、β和γ亚基的特定组合组成的异源三聚体蛋白，其α2链在骨骼肌的细胞外基质中高表达，Dystrophin-糖蛋白复合物由几种跨膜和外周成分组成，在骨骼肌的肌纤维膜中高表达，Dystroglycan是Dystrophin-糖蛋白复合物的核心蛋白，外周膜蛋白α-Dystroglycan以高亲和力结合Laminin α2链，同时与跨膜蛋白β-Dystroglycan相连，后者又与结合了细胞骨架肌动蛋白的Dystrophin相连，形成细胞外基质与细胞内骨架蛋白之间的机械连接[26-28]。机械刺激作用于骨骼肌，破坏细胞外基质-细胞骨架连锁，使肌纤维膜稳定性丧失、Laminin依赖性信号传导破坏、对肌肉收缩期间肋状体（costameres）侧向传递力耐受程度降低等，可能导致各种肌营养不良症的发生[27-29]。

本研究结果显示，不同浓度MGF促进肛提肌成肌细胞增殖的效果不同（P＜0.05）；不同MGF作用时间促进肛提肌成肌细胞增殖的效果不同（P＜0.05）；MGF浓度和MGF作用时间两因素间存在交互作用（P＜0.05），当 MGF浓度为 150 ng/mL、作用时间为72 h时肛提肌成肌细胞存活率最高。说明MGF浓度和MGF作用时间两因素可交互作用，促进体外培养的SUI患者的肛提肌成肌细胞增殖，证实了MGF的促增殖作用，与上述结论一致。不同于本研究，孙婧瑜等[30]以SD大鼠的腓肠肌卫星细胞为研究对象，证实了MGF的促增殖作用。吴国梁等[23]则对健康成年SD大鼠的腓肠肌进行被动拉伸训练，发现不管拉伸方式是持续性还是重复性，拉伸训练后SD大鼠腓肠肌MGF及其mRNA的表达水平均显著上升，同时腓肠肌湿重明显增加。

另外，本研究还发现，SUI组（0 ng/mL）与对照组比较，肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin的表达降低（P＜0.05）。与SUI组（0 ng/mL）比较，MGF组（150 ng/mL）肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin的表达增加（P＜0.05）。提示MGF可促进SUI患者肛提肌成肌细胞Laminin、Dystrophin的表达。Dystrophin表达降低与SUI发生的关系在王莉娜等[31]的研究中亦得到证实。Cação-Benedini等[27]在右后肢固定（保持足背完全跖屈）10 d大鼠的比目鱼肌中发现了Laminin和Dystrophin表达增加。MGF促进Laminin、Dystrophin表达的具体机制仍有待进一步研究。

综上所述，MGF可通过促进肛提肌成肌细胞的增殖以及Laminin、Dystrophin的表达来修复SUI患者损伤的肛提肌。生长因子注射疗法很有前景，未来的研究必须确定其使用的适应证、有吸引力的生长因子、最佳的手术技术和方法、最佳的实施注射时间、生长因子的剂量以及开发临床相关的动物模型，深入理解生长因子疗法改善SUI的机制。