肝组织中程序性死亡受体1与自身免疫性肝炎炎性反应的关系

何启军 符火 陈扬 许海霞

自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)主要由异常自身免疫反应介导，与性别、年龄、病毒、遗传等因素有关，但详细机制并不明确[1]。有资料显示，肝组织中程序性死亡受体1(Programmed death 1，PD-1)经调节T细胞分化和活化抑制传导信号，对免疫细胞功能发挥负性调控作用，与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症等免疫性疾病有关，并在原发性胆汁性胆管炎、AIH、慢性丙型肝炎患者肝内表达明显，推测自身免疫性肝病的发生与PD-1密切相关[2]。本研究纳入60例AIH患者进行系统分析，旨在探讨PD-1与AIH炎性反应的关系。

资料与方法

一、 一般资料

纳入海口医院2015年11月至2018年11月收治的AIH患者60例，男12例，女48例，年龄18～65岁，平均(47.1±12.1)岁。另选同期60例健康体检者为健康对照组，其中男14例，女46例，年龄18～67岁，平均(48.2±12.1)岁。按疾病活动程度，将60例患者分为AIH缓解期组18例，AIH活动期组42例。研究对象均签署知情同意书，获医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①参考《自身免疫性肝病诊断和治疗指南》[3]中AIH诊断标准，免疫球蛋白G或γ-球蛋白或总血清球蛋白浓度为正常上限1.5倍以上；血清天门冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶异常；血清抗体检测示平滑肌及血清抗核抗体或抗肝/肾微粒体抗体1型抗体滴度为1∶80以上；HAV和HBV阴性，肝组织学示界面性肝炎中或重度；②入组前30 d内无肝毒性药物服用史；③年龄≥18岁，首次发病，且为Ⅰ型AIH。排除标准：①严重心脑血管疾病及消化、呼吸系统疾病；②药物性、遗传代谢性、酒精性肝病等所致肝功能异常者；③合并肝性脑病、重叠综合征，或其他感染性疾病；④入组前3个月内服用糖皮质激素、甲氨蝶呤等；⑤精神疾患；⑥白细胞减少<2.5×109/L；⑦妊娠或哺乳期妇女。

二、肝组织PD-1检测

1.主要仪器与试剂：LH50A 型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、DHP-9052型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、MNl620型巴德一次性全自动活检枪(美国巴德公司)、HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统(武汉清平影像技术有限责任公司)。兔抗人PD-1抗体(英国Abcam公司)、二抗试剂盒SP-9001(北京中杉金桥生物技术有限公司)，二氨基联苯胺显色试剂盒购自英国Abcam公司。

2.标本处理：采用巴德一次性全自动活检枪，抽吸出索状肝组织(长约20 mm)，汇管区为8个及以上，4%甲醛固定24 h，石蜡包埋后连续切片(厚度约4 μm)，予以标记。通过烤片、脱水、封闭内源性过氧化物酶、抗原修复、滴加一抗、二抗及孵育、复染等处理后，高倍镜下观察20个视野，行免疫组织化学染色结果判定。由2名经验丰富的病理科医师采用双盲法阅片。

3.PD-1检测：采用免疫组织化学卵白素-生物素-酶复合物染色法进行PD-1检测，表达工作浓度1∶200，通过3%双氧水作用、抗原修复后，加入兔抗人PD-1抗体，4℃培养过夜，第2天清晨加入第二抗体，行显色、复染等处理。以PD-1阳性切片为阳性对照，并以磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照。阳性判定：肝细胞包膜和胞质出现棕黄色颗粒。

4.图像分析：采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统，每张切片取高倍视野5个，检测肝组织PD-1平均吸光度值、积分吸光度值，测量5个视野均值。

三、实验室指标检测

清晨空腹采血3 mL，离心后取上层血清，运用uniceL DxC800型全自动生化分析仪，总胆红素试剂盒购自宁波普瑞柏生物技术股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶，试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司；采用免疫比浊法检测免疫球蛋白A、G、M，试剂盒均购自美康生物科技股份有限公司。

四、观察指标

统计缓解期组与活动期组一般资料，观察各组PD-1阳性表达率，分析PD-1表达与肝脏炎性反应的关系，并探讨PD-1表达与总胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶的相关性。肝组织炎性反应判定[4]：按标本组织中肝细胞变性、坏死、炎性细胞浸润程度、汇管区纤维增生、纤维分隔形成病理改变状况，进行肝组织炎症活动度(G)分级，包括G0～G4级，其中无炎症：G0级；轻度炎症：G1～G2级；重度炎症：G3～G4级。

五、统计学方法

结 果

一、AIH缓解期与活动期组基线资料比较

AIH缓解期组总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、免疫球蛋白G显著低于AIH活动期组(P<0.05)，其他指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

二、 各组研究对象PD-1阳性表达率比较

AIH组PD-1阳性表达率为(13.58±6.82)%，显著高于健康对照组的(2.23±0.67)%，差异有统计学意义(t=12.829，P<0.01)。AIH活动期患者肝组织病理学改变多表现为界面性肝炎，伴汇管区炎性细胞(单核细胞、浆细胞、淋巴细胞)浸润，多数肝小叶内见碎屑样或点状坏死，汇管区炎症未侵犯胆管系统，PD-1阳性表达率为(16.52±7.70)%。AIH缓解期组未发现界面性肝炎，汇管区无浆细胞、淋巴细胞浸润及坏死，PD-1阳性表达率为(6.54±3.14)%。AIH活动期组PD-1阳性表达率显著高于AIH缓解期组及健康对照组，差异有统计学意义(t=5.293、7.823，均P<0.01)，见图1。

三、 PD-l与肝脏炎症的关系

60例AIH患者中，肝组织炎症活动度G0级18例、G1～G2级23例、G3～G4级19例，PD-1阳性表达率依次为(6.57±3.14)%、(14.30±5.05)%、(19.24±5.46)%。其中，G0级AIH患者PD-1阳性表达率显著低于G1～G2级、G3～G4级(t=5.683、8.588，均P<0.01)，G1～G2级AIH患者PD-1阳性表达率显著低于G3～G4级(t=3.042，P=0.004)，见图2。

四、 PD-1与总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶的相关性

直线相关分析显示，PD-1表达与总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶呈正相关(r=0.853、0.863、0.884，均P<0.01)，见图3～5。

讨 论

本研究结果显示，肝炎组PD-1阳性表达率明显高于健康对照组，而理论上AIH患者PD-1阳性表达率应明显下降，可能是机体为了应对自身免疫反应而产生的一种代偿机制，但PD-1上调并不能控制疾病发生及发展。柯坤宇[5]等也发现，AIH 患者肝组织PD-1表达明显高于健康对照组，提示其可能参与AIH的发病。此外，AIH活动期组PD-1阳性表达率明显高于AIH缓解期组，间接说明肝内浸润性T淋巴细胞已激活，发挥生物学功能，证实免疫抑制剂(如硫唑嘌呤、糖皮质激素等)可能经抑制T细胞活化，降低PD-1表达。有资料显示，表达PD-1的T、B细胞与其配体PD-L阳性细胞相互作用，能促使B、T细胞免疫效应下降，引起自身反应性淋巴结细胞功能受抑，进而预防外周组织被自身免疫攻击，证实其参与炎症病理发生、发展过程[6]。这可能是在共刺激通路中，PD-1/PD-L信号通路出现功能障碍，或正性刺激信号过强，远远高于负性抑制信号抑制免疫反应作用，引起机体免疫耐受紊乱，导致其无法实现免疫反应抑制性调控作用，最终诱导疾病发生。

表1 AIH缓解期组与活动期组基线资料比较

图1 各组患者肝组织中PD-1表达 A.健康对照组；B.AIH缓解期；C.AIH活动期

图2 AIH患者肝组织中PD-1表达 A.G0级AIH患者；B.G1～G2级AIH患者；C.G3～G4级AIH患者

图3 PD-1与总胆红素的线性相关图

图4 PD-1与天冬氨酸氨基转移酶的线性相关图

图5 PD-1与丙氨酸氨基转移酶的线性相关图

本研究发现，G0级AIH患者PD-1阳性表达率明显低于G1～G2级及G3～G4级，且G1～G2级AIH患者PD-1阳性表达率明显低于G3～G4级，与熊克宫等[7]报道相似，提示随着肝组织炎症活动的逐渐加重，患者PD-1阳性表达率呈明显上升趋势，证实PD-1与AIH炎性反应有关。另外，本研究结果显示，PD-1表达与总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶呈正相关，提示PD-1与肝脏炎症活动程度有关。Darb-Esfahani等[8]也发现，AIH患者肝组织PD-1呈高表达，与纤维化分级无明显关联，但与肝组织炎症活动度有关，表明PD-1参与AIH炎症发生、发展。笔者认为，PD-1与肝脏炎症活动有关，可能是肝脏炎性反应加重时机体的一种自我保护机制。具体而言，肝脏存在明显免疫介导的炎性反应活动时，机体免疫反应强，为预防肝组织损伤，机体PD-1呈高表达，抑制T细胞活性，诱导免疫应答下降，证实肝组织PD-1表达与病情慢性化进展相关。而PD-1/PD-L信号通路是AIH免疫逃逸的关键机制，在AIH发生、发展中起着重要作用，早期检测PD-1利于评估肝脏病理程度。

综上，AIH患者PD-1与肝脏炎性反应密切相关，临床上应引起足够重视。但本文样本量较少，干预时间较短，所得结论可能存在一定偏差。Zou等[9]报道，部分肝癌患者肝组织中PD-1表达上调，其预后比PD-1低表达者差，提示PD-1对肿瘤预后有一定作用。本文未涉及PD-1与AIH患者预后的关系，有待今后开展多中心、大样本的随机对照实验，以深入探索其机制。