LC-MS/MS法测定柚子皮中香豆素类物质组成及含量

郝元元

（乌兰察布职业学院，内蒙古乌兰察布012000）

柚[Citrus maxima（Burm）Merr.]为芸香科柑橘属乔木，在东南亚各国以及我国长江以南各地均有栽培，且品种繁多，因柚子果肉口感酸甜，富含维生素C，具有消食、理气、解酒毒等功效而深受人们喜爱[1-3]，但柚经食用或加工后每年都生产大量的柚子皮，除部分柚子皮被制成药材，大部分柚子皮被丢弃，既浪费资源，又污染环境。目前国内外科学工作者已报道柚子皮中含有活性多糖、黄酮类化合物、膳食纤维、柚子皮黄色素、柚子皮精油、果胶、柚皮苷等功效成分[4-9]。而芸香科柑橘属植物广泛含有香豆素及其衍生物，即一类具有芳香性气味的物质，结构类型多样，具有多种活性，是医药、农药、染料等精细化工产品的原料和中间体[10-14]。古淑仪等[11]采用X 射线单晶衍射仪测定化州柚未成熟干燥幼果中3 个7-甲氧基香豆素；胡甜恬等[12]采用多种色谱层析分离纯化，经波谱分析新鲜沙田柚皮的95 %乙醇提取物中分离得到10 个香豆素类化合物；王辉等[13]采用高效液相色谱-质谱法测定沙田柚果肉汁中6 种呋喃香豆素类化合物，而关于柚子皮中香豆素及其衍生物的研究报道较少[14-15]。本研究采用碱性甲醇超声萃取香豆素及其衍生物，经C18柱分离，采用液相色谱－质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）对柚子皮中8 种香豆素及其衍生物含量进行质谱检测，为农业废弃物柚子皮的综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂、材料

Waters ACQUITY Xevo TQ MS 型高效液相色谱仪-三重四级杆质谱仪：美国Waters 公司；BS224S 型电子天平：德国Sartorius 公司MM400 型研磨仪：德国RETSCH 公司；MixPlus 涡旋混合仪：合肥艾本森科学仪器有限公司；YQ-1000C 型超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司；Rotavapor R-210 旋转蒸发仪：瑞士BUCHI 公司；ULUP-Ⅱ型超纯水机：西安优普仪器设备有限公司。

8 种香豆素及其衍生物标准物质：香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6－甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、环香豆素、醋硝香豆素、双香豆素：纯度均≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司，具体信息见表1；甲酸、乙酸铵：均为色谱纯，美国Sigma 公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷：均为色谱纯，美国Tedia 公司；其余试剂均为分析纯：西陇化工股份有限公司；试验用水均为超纯水。

表1 香豆素及其衍生物标准物质信息Table 1 Standard substance information of coumarin and its derivatives

香豆素及其衍生物标准储备液（10.0 mg/mL）：分别准确称取香豆素及其衍生物0.1 g（精度至0.1 mg），用少量甲醇溶解后定容至10 mL 容量瓶中，-20 ℃保存。

6 份不同产地的柚子，产地分别为广东梅州（沙田柚）、广东化州（化州柚）、浙江苍南（四季柚）、浙江常山（常山胡柚）、福建漳州（琯溪蜜柚）、重庆垫江（垫江白柚），剥去果肉后，将柚子皮置于恒温干燥箱中，70 ℃烘干24 h，粉碎，过100 目筛后备用。

1.2 LC-MS/MS条件

液相色谱条件：Waters XBrigde C18色谱柱（150 mm×4.6mm，3.5μm）；流动相 A 为乙腈，流动相 B 为 0.05mol/L乙酸铵溶液（含0.1 %甲酸）；柱温为30 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量：10 μL；流动相梯度洗脱条件见表2。

表2 梯度洗脱条件Table 2 The mobile phase gradient program

质谱条件：电离方式为电喷雾电离（electron spray ionization，ESI），采用正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式扫描，采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式进行监测；离子源温度为500 ℃。ESI+模式时：毛细管电压为3.5 kV，锥孔气流速为50 L/h，脱溶剂气温度为350 ℃，去溶剂气流量为700 L/h；ESI-模式时：毛细管电压为2.2 kV，锥孔气流速为50 L/h，脱溶剂气温度为400 ℃，去溶剂气流量为800 L/h。8 种香豆素及其衍生物的电离方式、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表3。

表3 香豆素及其衍生物的质谱参数Table 3 Mass spectrometric parameters of coumarin and its derivatives

1.3 样品前处理

准确称取柚子皮粉5 g（精度至0.1 mg）置于100 mL离心管中，加入20 mL 甲醇，涡旋混合后，在超声波水浴中超声提取30 min，以10 000 r/min 离心5 min，收集上清液；残渣用20 mL 甲醇超声提取2 次，合并上清液，35 ℃旋转蒸发浓缩至5 mL；浓缩液经Oasis HLB固相萃取柱净化，净化液经0.22 μm 滤膜过滤，滤液供LC-MS/MS 测定。

1.4 标准工作曲线的绘制

分别移取香豆素及其衍生物标准储备液（10.0 mg/mL）适量置于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释配制成质量浓度依次为 0.01、0.05、0.10、0.50、1.0 μg/mL的香豆素及其衍生物混合标准工作溶液，经LC-MS/MS 测定，以香豆素及其衍生物标准工作溶液质量浓度为横坐标，以其相对应的色谱峰响应值为纵坐标，绘制标准工作曲线。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

采用注射泵将1.0 μg/mL 的香豆素及其衍生物单标连续直接进样，采用正负离子模式进行全扫描，以选择准分子离子（母离子）和电离方式。结果表明：双香豆素和醋硝香豆素在电喷雾负离子（ESI-）电离方式下，可获得响应值较高的[M-H]-母离子；香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6－甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、环香豆素在电喷雾负正离子（ESI+）电离方式下，可获得响应值较高的[M+H]+母离子；采用子离子扫描方式对母离子进行二级质谱分析，通过优化毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，使得8 种香豆素及其衍生物的母离子及其子离子的相对强度达到最大，将响应值最大的子离子设为定量离子，响应值较稳定的子离子设为定性离子，8 种香豆素及其衍生物的质谱参数信息具体见表3，质谱总离子流图见图1。

2.2 色谱柱的选择

分别考察了Waters XTerra MS C18、Waters XBrigde C18、Hypersil BDS C18、Symmetry C18等不同微粒填料的色谱柱对8 种香豆素及其衍生物的分离效果（图1）。结果表明：在不同型号的C18柱上，8 种香豆素及其衍生物的分离效果存在显著性差异，特别是当采用Wa－ters XBrigde C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）色谱柱时，各化合物的色谱峰更为符合正态分布，且分离效果好，响应值较高，故选择Waters XBrigde C18作为分析柱。

图1 香豆素及其衍生物标准溶液的质谱总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of coumarin and its derivatives

2.3 流动相的选择

采用Waters XBrigde C18作为分析柱，分别考察甲醇/乙腈和不同浓度的乙酸铵溶液为流动相体系时对香豆素及其衍生物的色谱分离及其离子化响应情况。试验结果显示，香豆素及其衍生物的质谱响应值和保留时间随着乙酸铵浓度的改变而发生变化，当乙酸铵浓度为0.05 mol/L 时，基线平稳，峰形对称，且保留时间适中，特别是当0.05 mol/L 乙酸铵溶液中添加0.1%甲酸时，可提高香豆素及其衍生物的质谱响应值和灵敏度（图1）。故选择乙腈-0.05 mol/L 乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）作为流动相。

2.4 萃取溶剂的选择

考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等萃取溶剂对8 种香豆素及其衍生物的萃取效果见图2。

图2 萃取溶剂对香豆素及其衍生物的萃取效果Fig.2 Effect of extraction solvent on the effect of coumarin and its derivatives

从图2可以看出：按8 种香豆素及其衍生物平均萃取率大小依次排序为：甲醇（96.2%）＞乙腈（91.5%）＞乙酸乙酯（88.4 %）＞二氯甲烷（84.1 %）＞正己烷（67.3%），其中甲醇对8 种香豆素及其衍生物的萃取率在87.6%～99.4%之间，平均值为96.2%。故选择甲醇作为萃取溶剂。

2.5 净化柱的选择

考察WCX（弱阳离子柱）、WAX（弱阴离子柱）、MCX（混合型阳离子柱）、MAX（混合型阴离子柱）、HLB（亲水-亲酯柱）、AluN（中性氧化铝柱）等不同极性固相萃取柱对8 种香豆素及其衍生物的净化效果见图3。

从图3中可知，HLB（亲水-亲酯柱）对8 种香豆素及其衍生物的平均净化率最高（平均净化率为96.3%），这可能是因为HLB 具有亲水-亲酯平衡化学结构，对不同极性的香豆素及其衍生物混合物具有良好的均衡吸附作用。故选择HLB 作为净化柱。

图3 不同固相萃取柱对香豆素及其衍生物平均净化率的影响Fig.3 Effect of solid phase extraction column on the recovery rate of coumarin and its derivatives

2.6 基质效应

为提高本文所建LC-MS/MS 法的特异性和降低样品基质对香豆素及其衍生物含量测定的影响，考察了香豆素及其衍生物在柚子皮萃取液和纯乙腈两种不同基质中的响应值比值来衡量基质效应（matrix effect，ME）。ME/%=A/B×100%，其中 A 为柚子皮萃取液中香豆素及其衍生物的响应值，B 为纯乙腈中香豆素及其衍生物的响应值；若ME＞10%，表明存在基质增强效应；若-10%＜ME＜10%，表明不存在基质干扰效应；若ME＜-10%时，表明存在基质减弱效应。结果表明，在柚子皮萃取液和纯乙腈两种基质中分别加入10.0、500.0、1 000.0 μg/kg 3 种低中高浓度的 8 种香豆素及其衍生物标准混合溶液，经本文所建LC-MS/MS法测定柚子皮中8 种香豆素及其衍生物的基质效应ME 值在-3.7%～4.6%见表4，这表明不存在基质干扰效应。

表4 香豆素及其衍生物在纯乙腈和柚子皮中的基质效应Table 4 Matrix effect of coumarin and its derivatives in pure acetonitrile and Citrus maxima

2.7 线性范围和检出限

在空白柚子皮中添加不同浓度的香豆素及其衍生物标准储备液，按“1.3 样品前处理”和“1.2 HPLCMS/MS 条件”进行测定，以香豆素及其衍生物标准工作溶液质量浓度为横坐标（x，mg/mL），以其相对应的色谱峰响应值为纵坐标（y，cps），绘制标准工作曲线，计算回归方程；在空白柚子皮中添加一系列低浓度的香豆素及其衍生物混合标准工作溶液，按“1.3 样品前处理”和“1.2 HPLC-MS/MS 条件”进行测定 11 次，分别以 3 倍信噪比（S/N=3）和 10 倍信噪比（S/N=10）计算方法检出限（LODs）和定量限（LOQs）见表5。

表5 线性范围、相关系数、检出限及定量限（n=6）Table 5 Linear range，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation（n=6）

从表5中可知：在 0.010μg/mL～1.0 μg/mL 范围内，香豆素及其衍生物具有良好的线性关系（R2≥0.999 5）；LODs 在 3.0 μg/kg ～4.5 μg/kg；LOQs 在 10.0 μg/kg ～15.0 μg/kg。

2.8 加标回收率与精密度

分别在空白柚子皮中添加10.0（低浓度）、500.0（中浓度）、1 000.0 μg/kg（高浓度）3 种水平的香豆素及其衍生物混合标准工作溶液，按“1.3 样品前处理”和“1.2 HPLC-MS/MS 条件”进行加标回收率和精密度测定见表6。

从表6中可知，香豆素及其衍生物的平均加标回收率为90.4%～98.5%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为 0.9 %～4.1 %，该方法的准确度、精密度均符合方法学的要求。

表6 加标回收率和精密度（n=6）Table 6 Recoveries and precision（n=6）

2.9 实际样品的检测

将6 份来自不同产地的柚子皮（沙田柚、化州柚、四季柚、常山胡柚、琯溪蜜柚、垫江白柚），按“1.3 样品前处理”和“1.2 HPLC-MS/MS 条件”进行测定柚子皮中香豆素及其衍生物的组成及其含量见表7。

表7 实际柚子皮中香豆素及其衍生物的组成及其含量Table 7 Composition and content of coumarin and its derivatives in Citrus maxima

从表7中可知，柚子皮中含有一定量的香豆素及其衍生物，这与古淑仪等[11]、王辉等[13]关于柚子皮中香豆素及其衍生物的研究报道一致；6 种不同品种的柚子皮中均含有7-甲氧基香豆素，且7-甲氧基香豆素含量较高，含量在 11.4 μg/kg～123.7 μg/kg，而 7-甲氧基香豆素具有一定的生物活性的药物，具有平喘、祛痰、镇咳的作用，该成分可能与柚子具有的暖胃、化痰、润化喉咙等食疗作用相关；在所检的6 种柚子皮中，均未检出香豆素、6-甲基香豆素、环香豆素、双香豆素；不同品种的柚子皮中含有的香豆素及其衍生物不同，这可能与品种、气候、贮藏时间等因素不同而引起的差异，可为农业废弃物柚子皮的综合开发利用提供科学依据。

3 结论

针对6 份不同产地的柚子皮，经甲醇超声提取，Oasis HLB 固相萃取柱净化，Waters XBrigde C18色谱柱分离，以乙腈和0.05 mol/L 乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测检测，建立了液相色谱-质谱法测定柚子皮中8 种香豆素及其衍生物的检测方法。结果表明：在0.010 μg/mL～1.0 μg/mL范围内，香豆素及其衍生物具有良好的线性关系（R2≥0.999 5）；方法检出限在 3.0 μg/kg～4.5 μg/kg，定量限在10.0 μg/kg～15.0 μg/kg；加标回收率在 90.4%～98.5%，相对标准偏差在0.9%～4.1%；在6 种不同品种的柚子皮中检出7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、醋硝香豆素，其中7-甲氧基香豆素含量较高，含量在 11.4 μg/kg～123.7 μg/kg，该成分可能与柚子具有暖胃、化痰、润化喉咙等食疗作用相关，这为柚子皮综合开发利用提供参考。