类固醇激素受体起始密码子区突变位点报告基因系统的构建

毕红东 李宝群 万立野

(1承德医学院，河北 承德 067000；2承德医学院附属医院)

类固醇激素受体(VDR)是核转录因子的一种，属于/甲状腺激素受体超家族的成员。1，25(OH)2D3与VDR结合为激素受体复合物后能够调节靶基因的转录，调控细胞分化与抑制增殖〔1〕；调控药物代谢酶及内外源性物质转运体等〔2〕。近年来针对VDR在内的类固醇激素受体基因突变的研究逐渐成为热点〔3〕。野生型VDR编码的蛋白质含有427个氨基酸，起始密码子区突变造成ATG中的(T)变异为(C)后导致突变型蛋白质变为424个氨基酸，体外研究显示将携带VDR的cDNA质粒转染人结肠癌细胞系COS-7后发现癌细胞表达VDR mRNA，并且生长与其特异性配体骨化三醇的剂量相关，表明1，25(OH)2D3抗肿瘤作用是通过受体VDR介导〔4〕。临床研究发现患者携带VDR基因型不同则肿瘤易患性也不同〔5〕；目前对VDR基因翻译起始密码子变异的研究多集中在突变与疾病发生方面，并未对具体调控做系统的分析。本研究利用分子遗传学技术，通过构建报告基因载体，利用细胞转染来验证其表达活性，为进一步深入研究该基因提供体外平台。

1 材料和方法

1.1材料 Trizol 试剂(Hyclone)，质粒小量提取试剂盒和质粒DNA大量制备试剂盒以及DNA 胶回收试剂盒(Qiagen公司)，逆转录试剂盒购自Promega公司，T4 DNA连接酶，T4 PNK RT-PCR 试剂盒，GeneRuler 100 bp DNA Ladder购自MBI公司，EcoRⅠ内切酶，XhoⅠ内切酶HindⅢ 内切酶，STAR HS DNA聚合酶、5倍缓冲液dNTP DNA JM109菌种(TIANGEN)；普通琼脂糖、低熔点琼脂糖，氨苄青霉素，酵母，FBS，LB液体培养基均购自TaKaRa公司，COS-7细胞株(上海细胞所)，载体pcDNA3.1(-)B-myc/his，PGEM-T载体，pGL3-promoter载体内切酶和聚合酶购自TaKaRa公司；Dual-Luciferase Reporter Assay system和DMEM和血清购自Invitrogen公司，PCR引物合成由上海博亚公司。

1.2方法

1.2.1人VDR基因克隆 Trizol法制备总RNA，野生型所用引物：5′-tagaattctggaggcaatggcggc-3′和5′-actaagctttctcattgccaaacacttc-3′；突变体所用的引物为5′-tagaattcgtggcggccagcacttc-3′和5′-actaagcttgtcattgccaaacacttc-3′将肝脏组织(承德医学院生物标本库)在液氮中磨碎，Trizol法制备。PCR体系和条件：产物2.5 μl，dNTP 1.5 μl，5×缓冲液5 μl，前引物0.5 μl，后引物 0.5 μl，0.5 μl聚合酶，混匀后上样置于PCR仪，参数设定为94 ℃10 min开始，然后55℃15 s，而后72 ℃90 s，一共35 个循环，最后再次72℃10 min。将T4 DNA连接酶与PGEM-T克隆载体将cDNA目的片段进行连接。

1.2.2野生型和起始密码子区突变VDR真核表达载体的构建 VDR目的片段(约1.3 kb)纯化后从T克隆载体上消化后与表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/his连接，连接体系如下：缓冲液1 μl，T4连接酶1 μl，PCR 产物5 μl补水至10 μl，产物与载体比例为1∶4，混匀离心后转化感受态细菌，初步鉴定采用酶切电泳，最终鉴定采用测序(上海英骏生物公司)。野生型载体人VDR构建成功后以其为模板引入突变位点引物进行PCR扩增，按同样方法将扩增后产物与表达载体pcDNA3.1-myc/his B(-)连接，测序验证命名为人VDR起始密码子区突变型(图1)。

图1 真核表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/his/人VDR

1.2.3转染处理 DMEM+10%FBS培养基培养COS-7，在37 ℃和CO2为5%的条件下，当细胞汇合生长到80%时传代接种至96 孔培养板上。用不含血清的DMEM培养基配制的转染试液，海肾荧光素酶报告质粒用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂，平行6 个孔，每个样品至少重复3次。转染实验分为两组，一组为野生型载体组，另一组为突变体VDR，以phRL-SV40报告载体作为内对照；空载体pcDNA3.1(-)B-myc/his为空白对照；各待检载体进行共转染及药物处理。

1.2.4双荧光素酶活性分析 报告基因试剂处理30 h后，细胞用PBS洗涤1次，加入裂解液裂解细胞，在检测管中加入药物1，25(OH)2VD3，对照phRL-SV40和Lip 2000混匀后放置于检测孔中测定荧光素酶活力。

1.3统计处理 采用SPSS20.0软件进行t检验和方差分析。

2 结 果

2.1真核表达载体人核受体野生型VDR的构建 VDR全长扩增应用RT-PCR方法，VDR cDNA为427个氨基酸(约1.3 kb)，扩增产物片段与理论相符，扩增产物和载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后进行连接形成重组载体pcDNA3.1(-)B-myc/his/人VDR(图1和图2)，提质粒再次行上述两种酶切检测并同时测序，GenBank序列分析表明，酶切片段长度与插入片段和目的片段长度序列方向完全一致，核受体VDR mRNA编码区已重组到表达载体中(见图3，图4)。

泳道1：Ladder(3 kb)；2～6泳道：重组VDR双酶切后的片段〔目的片段1.3 kb，空载体 PC-DNA3.1(+)/-his 5.5 kb〕；2与6泳道：野生型；3～5泳道：突变体图2 重组表达质粒pcDNA3.1(-)B-myc/his/h VDR(野生型与突变型)酶切结果

图3 野生型人VDR测序分析

图4 突变型人VDR测序分析

2.2真核表达载体人核受体VDR突变型的构建 以野生型人VDR质粒菌液作模板，根据CDR起始密码子区T/C突变设计相应引物(与野生型相比丢失3个氨基酸也就是9个碱基)，所以片段长度基本不变(1.3 kb)，PCR扩增hVDR突变全长cDNA其余方法同构建野生型载体。同样用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切检测(图2)。挑选阳性克隆进行测序然后进行质粒大量抽提做细胞转染备用。

2.3荧光素酶报告基因载体的构建 通过共转染pcDNA3.1-VDR-和pGL3-VDR-luc及内对照质粒pRL-SV40 建立的 VDR报告基因体系，随着特异性配体浓度的增加荧光素酶表达量也随之增加，转染野生型和突变体的VDR质粒载体在3个1，25(OH)2VD3浓度组，代表VDR转录活性的荧光素酶比活性值与溶媒对照及空载体对照有显著差异，转染突变体组mRNA水平的转录激活能力高于转染野生型组(图5)。

图5 各处理组荧光素酶比活性值的比较

3 讨 论

真核表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/his大小为5.5 kb，携带有多克隆酶切位点和巨细胞病毒(pcMV)加强型启动子合并含有抗新霉素基因，许多哺乳动物真核细胞都可以高效表达，因此应用pcDNA3.1(-)B-myc/his作为表达载体可为研究目的基因表达奠定良好的实验基础；另外我们以PGEM-T作为克隆载体，主要是因为T连时只做单酶切不用做方向性选择，操作简单及连接效率较高。而且pcDNA3.1(-)B-myc/his(空)大小为5.5 kb，PGEM-T本身仅3 kb长，如果做定点突变那么空载体略显过长会导致诱变效率低下。本模型采用荧光素酶检测表达载体转录活性是基于以下几点：荧光素酶检测及其灵敏且速度很快在几秒钟内可以完成两种荧光素酶的测定，不但方便而且可避免放射性物质；同时上样无需预处理且对内源背景要求较低，高通量药物筛选选用次方法最为适用；线性范围分析数量级可达10个左右，微量细胞裂解物即可满足实验所需；大量转染细胞后的荧光素酶报告基因分析系统还可在细胞96孔板进行，报告基因分析也会受转染效率或细胞活性等因素影响，为此我们设立了启动子转录的海肾荧光素酶作为内对照报告基因与实验报告基因共转染的方法以降低细胞数目、状态、转录和裂解效率等原因造成的误差，从而使得结果更加准确。有关类固醇激素受体VDR对下游一系列靶基因的转录调控的研究近来日益受到重视。体外细胞水平已经证实1，25(OH)2D3通过受体VDR调控下游靶基因转录表达，而受体被iRNA干扰后其诱导作用几乎消失〔6〕。在美国黑人、白人、新加坡人的研究中分别发现起始密码子区突变者结肠肿瘤易患性比野生型和杂合子基因型者显著降低〔7〕。但是此位点突变与肿瘤发生是否存在关联及其机制目前缺乏相关的研究，本实验构建了含有人类固醇激素受体VDR起始密码子突变的报告基因系统，通过转染COS-7 细胞验证了VDR具有转录活性，为揭示受体在疾病发生反应差异的遗传机制和证实遗传变异对疾病发生发展的影响起决定作用的分子机制初步搭建了一个体外实验平台。