雷洛昔芬对高糖高脂饮食小鼠主动脉瓣功能的影响

李大刚 杨熠 刘海燕 罗滨

(暨南大学附属第二临床医学院 深圳市人民医院 1心脏大血管外科，广东 深圳 518020；2妇科；3深圳市宝安区人民医院心血管外科)

随着人口老龄化的加剧及动脉粥样硬化发病率的增高，心脏瓣膜病的发病率在逐年增加，其中老年退行性主动脉瓣病变在心脏瓣膜病变中占据了较大的比例〔1，2〕。主动脉瓣膜间质细胞是心脏主动脉瓣膜中含量最为丰富的细胞，具有保持瓣膜正常结构和功能的重要作用〔3〕。瓣膜间质细胞凋亡和钙结节形成参与了瓣膜退行性病变和钙化形成。其生物学功能的改变对主动脉瓣膜病变的发生起重要作用〔4〕。雷洛昔芬(RAL)属于第二代选择性雌激素受体调节剂(SERM)，最初主要用于女性绝经期后骨质疏松和乳腺癌的治疗，后来在心血管方面研究发现，RAL 和其他一些SERM 均具有改善血管内皮细胞功能，扩张冠状动脉，调节血脂等功能，并且对动脉粥样硬化和静脉血栓形成等疾病亦具有保护作用〔5，6〕。RAL通过雌激素效应元件(ERE)或其他途径调节血管内皮细胞功能，从而保护血管内皮功能〔7，8〕。本研究通过对高糖高脂饮食的小鼠给不同浓度的RAL 3个月，检测RAL对主动脉瓣脂肪化和钙化的影响及相关凋亡基因的作用。

1 材料和方法

1.1动物 共50只雄性C57小鼠(10周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养在深圳市人民医院无特定病源动物房。深圳人民医院实验动物伦理委员会同意本研究所有实验。

1.2RAL给药实验 小鼠随机分为5组，每组10只。对照组(普通饲料喂养)、高糖高脂组(高糖高脂饮食)、RAL低剂量组(RAL 4.5 mg/kg+高糖高脂饮食)、RAL中剂量组(RAL 9.0 mg/kg+高糖高脂饮食)、RAL高剂量组(RAL 18.0 mg/kg+高糖高脂饮食)。每天灌胃给药共3个月，实验期间每天观察动物饮食活动情况。

1.3实时定量PCR 给药3个月后断颈处死动物。实时定量PCR(RT-qPCR)检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的相对表达水平。解剖取主动脉瓣组织提取总RNA用TRIzol 试剂盒(Invitrogen，USA)。RNA的浓度和纯度用紫外分光光度计检测其在260和280 nm的吸光度。逆转录反应用逆转录酶试剂盒(宝生物工程有限公司)完成，每反应10 μl总体系。RT-qPCR用预混液试剂盒(宝生物工程有限公司)完成，每反应20 μl体系。PCR扩增用一步法定量PCR系统完成(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，Caspase-3的相对表达水平参照标准化的β-actin内参，数据采用2-ΔΔCt表示，并评估样本间差异。上述各试剂盒操作根据供应商操作说明。Caspase-3：正义链5′-TGTCATCTCGCTCTGGTACG-3′，反义链5′-CCCTTTCTGCCTGTCTTCTG -3′；GDPDH：正义链5′-ACCTCAACTACATGGTCTAC-3′，反义链5′-TTGTCATTGAGAGCAATGCC-3′。

1.4组织学检测 给药3个月后断颈处死动物。取心脏主动脉瓣组织，在4%的甲醛缓冲液固定24 h，用逐级乙醇和二甲苯充分脱水与透明，56～58℃石蜡包埋，组织切片厚5 μm，脱蜡至水。用苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(南京建成生物科技有限公司)染色。茜素红染色：观察主动脉瓣组织钙盐沉积情况。茜素红染色步骤为切片脱蜡至水后自来水洗2 min，0.1 %茜素红染色30 min，甘油明胶封片。免疫组化染色：切片脱蜡至水后，3%过氧化氢(H2O2)溶液灭活内源性过氧化物酶，高压或酶消化修复抗原，加入Caspase-3抗体(1∶40)室温孵育2 h，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。滴加50 μl即用型快捷免疫组化试剂，室温下孵育10 min，滴加二氨基联苯胺(DAB)显色液，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。以出现棕黄色颗粒为阳性信号。结果用Image Proplus6.0(IPP6.0)专业图像分析软件进行图像定量分析，计算各组的IOD值。

1.5统计学处理 采用SPSS17.0软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1组织学分析 HE染色发现高糖高脂组小鼠主动脉瓣组织出现了大量脂肪化区域，给不同浓度的RAL后主动脉瓣脂肪化得到了不同程度的改善，尤其是RAL高剂量组发现很少脂肪化区域。见图1。茜素红染色发现高糖高脂组小鼠主动脉瓣组织出现了大量点状红色钙盐沉积区域，但是在不同浓度RAL药物组这种点状红色钙盐沉积点明显减少了，尤其RAL高剂量组基本没有呈现这种钙化点。见图2。免疫组化发现高糖高脂组小鼠主动脉瓣标本切片有大量的棕黄色Caspase-3蛋白阳性表达，同时阳性表达区域定量分析也发现高脂高糖组明显高于RAL低、中、高剂量组及对照组(P<0.05,P<0.01)，且RAL高剂量组极少观察到阳性表达。见图3、表1。

图1 不同浓度的RAL对高糖高脂饮食小鼠心脏瓣膜影响(HE染色，×200)

图2 不同浓度的RAL对高糖高脂饮食小鼠心脏瓣膜影响(茜素红染色，×200)

图3 不同浓度的RAL对高糖高脂饮食小鼠心脏瓣膜Caspase-3蛋白表达的影响(免疫组化染色，×200)

2.2RT-QPCR检测Caspase-3 mRNA相对表达水平 RAL低、中、高剂量组及对照组小鼠主动脉瓣组织中Caspase-3 mRNA表达均显著低于高糖高脂组(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 各组Caspase-3 mRNA及蛋白表达比较

与高糖高脂组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

3 讨 论

心脏瓣膜病是危害人类健康的重要疾病，随着年龄的增长退行性变性导致的主动脉瓣膜病变在心脏瓣膜病变中占主导地位，是导致主动脉瓣病变和接受主动脉瓣置换手术的最常见的原因〔9，10〕。主动脉瓣病变是一个复杂的病理过程，过去主动脉瓣膜的病变被普遍认为是一种长期机械压力诱导下的被动的、非调控的过程。目前，由于对主动脉瓣膜病变的发生和发展机制缺乏了解，对于早期瓣膜病变缺乏有效的干预手段。瓣膜的钙化是该病主要病理症状，是受到活跃调控的主动的生物学过程〔11〕，这个复杂的调控过程中，瓣膜间质细胞的增殖和凋亡参与瓣膜病变和钙化形成〔12，13〕。研究表明，高脂饮食可诱导新西兰大白兔的瓣膜出现病变，而在病变的瓣膜中细胞凋亡的数目明显增加〔14〕。

RAL在心血管疾病方面有治疗作用〔15〕，可改善血管内皮细胞功能〔16，17〕，扩张冠状动脉，调节血脂〔18〕，并且对动脉粥样硬化和静脉血栓形成有保护作用〔19，20〕。RAL通过抑制主动脉瓣膜间质细胞的凋亡，对肾功能不全所致的瓣膜钙化具有改善作用〔21〕。

长期高脂高糖饮食是心脏脂肪化的主要原因，本研究结果发现单纯高糖高脂饮食小鼠主动脉瓣组织出现了大量脂肪化区域，给不同浓度的RAL后主动脉瓣脂肪化得到了不同程度的改善。钙化程度分析发现高糖高脂饮食小鼠主动脉瓣组织出现了大量点状红色钙盐沉积区域，但是在不同浓度RAL药物组这种点状红色钙盐沉积点明显减少了，尤其高浓度RAL组基本没有呈现这种钙化点。调控主动脉瓣间质细胞凋亡的蛋白表达定量分析发现在给RAL后其表达也得到了一定程度的抑制。

综上所述，本研究通过建立高糖高脂饮食小鼠主动脉瓣膜退行性病变模型，观察不同浓度的RAL对主动脉瓣膜生物学功能的影响。发现合适的浓度RAL对主动脉瓣膜病变有一定的抑制作用，从而为RAL防治主动脉瓣膜疾病提供一定的实验参考。