海藻酸钠支架复合工程化软骨对佐剂性关节炎兔的抗炎作用机制

周彦邑 张旭东，2 蒋雯雯 韦登明

(1宁波大学医学院病理学系，浙江 宁波 315211；2湖北医药学院实验动物中心)

类风湿关节炎(RA)，是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫疾病，涉及免疫系统中的多种细胞因子、酶等〔1〕，引起关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成，并可出现关节软骨和骨质破坏，最终可导致关节畸形和功能丧失。RA关节软骨损伤目前尚无理想的治疗方法，传统的治疗可通过自体软骨移植(如利用自体骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞〔2〕)和同种异体软骨移植进行软骨缺损治疗，但各有局限。支架材料、种子细胞和细胞生长因子的组织工程技术为关节软骨缺损修复开辟了新道路，在临床应用上取得显著效果〔3，4〕。研究发现Th17细胞和Treg细胞间的平衡失调可能与RA的发生有着重要关系〔5，6〕。研究表明〔7〕，利用海藻酸钠支架复合组织工程化软骨细胞对佐剂性关节炎(AA)导致的软骨缺损有一定的疗效，能够减轻局部炎性反应，但抗炎机制尚不清楚。本研究观察海藻酸钠支架复合软骨细胞对AA兔关节滑膜Th17和Treg细胞相关细胞因子白细胞介素(IL)-10、IL-22及转化生长因子(TGF)-β1的表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 2月龄雄性新西兰兔40只，清洁级，体重2～3 kg，购自浙江省余姚泗门镇建飞实验兔养殖场，许可证号：SCXK(浙)2012-0050。适应性喂养1 w后随机分成正常组、模型组、支架组、软骨细胞组、支架复合软骨细胞组各8只。

1.2试剂 乌拉坦、Percoll细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)，完全弗氏佐剂(FAC)、海藻酸钠粉剂(美国Sigma公司)，胎牛血清、RPMI1640型培养基(美国HyClone公司)，胰蛋白酶、阿利新蓝(上海生工生物工程有限公司)，兔抗IL-10多克隆抗体、兔抗IL-22多克隆抗体、兔抗TGF-β1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，Bio-Swamp兔IL-10、IL-22、TGF-β1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海桥杜生物科技有限公司)，链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3仪器 光学显微镜(CX40，日本Olympus公司)、台式超高速低温离心机(Centrifuge 5810R，德国Eppendorf公司)、超净工作台(C1-9，上海江龙仪表电子有限公司)、二氧化碳细胞培养箱(3111，美国Thermo Fisher Scientific公司)、包埋机(BM-Ⅶ，宏业医用仪器公司)、石蜡切片机(HM-325，德国LEICA公司)。

1.4AA兔模型制备 10%乌拉坦按3 ml/kg剂量对兔耳缘静脉进行注射麻醉，观察兔睫毛反射，待反射消失，向模型组和各治疗组兔右膝关节内分别注射0.5 ml FCA，2 w后再次注射，正常组注射等量生理盐水。21 d后观察到注射FCA的兔右膝关节局部出现红肿，且较正常组明显肿大，标志造模成功。

1.5兔自体骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞 抽取软骨细胞组和支架复合软骨细胞组兔骨髓，自体骨髓间充质干细胞的提取，分离、培养、诱导分化与鉴定等各步操作参照文献〔8〕。

1.6回注治疗 骨髓间充质干细胞成功诱导为软骨细胞后，向支架组兔膝关节注射0.50 ml海藻酸盐支架；软骨细胞组注射0.50 ml软骨细胞悬液；支架复合软骨细胞组注射0.25 ml海藻酸盐支架和0.25 ml软骨细胞悬液的混合物；模型组和正常组注射0.50 ml生理盐水，治疗1个月。

1.7兔膝关节组织病理学检查

1.7.1兔膝关节滑膜苏木素-伊红(HE)染色 治疗结束后处死所有兔子，取各组膝关节，中性甲醛固定液固定，用乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液进行脱钙4 w，取材，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片制作石蜡切片标本，HE染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下镜检。

1.7.2膝关节滑膜免疫组化染色 石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次2 min；0.01 mol/L枸橼酸修复液微波抗原修复6 min，沸腾后室温放置10 min，重复2次，冷却至室温，PBS冲洗3次，每次3 min；5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭20 min，甩掉封闭液，勿洗；组织标本在湿盒中分别滴加IL-10、IL-22、TGF-β1一抗工作液，4℃冰箱过夜；37℃恒温箱1 h，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶重合物(SABC)工作液，37℃恒温箱30 min，PBS冲洗4次，每次5 min，双蒸水洗1次；滴加DAB显色剂，镜下观察适时终止显色，双蒸水洗1次，苏木素轻度复染3 min，流水冲洗后温水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。随机选取切片各5张，在400倍镜下各随机选取4个视野用JD801形态学图像分析系统进行图像分析，测定各指标阳性产物的积分光密度(OD)。

1.8统计学分析 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1兔膝关节软骨组织形态结构 造模21 d后，正常组兔膝关节触摸坚硬无红肿；而模型组明显红肿。治疗结束后，正常组兔膝关节软骨表面光滑，呈透明状，关节腔内无积液，周围没有出现组织增生的现象；模型组可见关节软骨呈凹陷缺损，呈乳白色，关节腔内可见大量积液，周围组织增生现象严重，甚至出现关节畸形现象；各治疗组表面光滑呈半透明状，关节软骨缺损部分有所改善，没有明显增厚的乳白色组织，但仍可见被侵蚀的痕迹。

2.2兔膝关节滑膜HE染色结果 正常组关节滑膜未见炎性细胞浸润，模型组炎性细胞浸润严重，各治疗组较模型组炎性反应均有所减轻。软骨细胞组较支架组减轻的多，支架复合软骨细胞组炎性反应最轻，抗炎效果最好，见图1。

2.3IL-10、IL-22、TGF-β1在兔膝关节滑膜的表达 模型组兔膝关节滑膜组织IL-10表达较正常组明显减少，IL-22、TGF-β1较正常组明显增多(均P<0.01)；与模型组相比，各治疗组兔膝关节滑膜组织IL-10表达明显增(P<0.05，P<0.01)，软骨细胞组和支架复合软骨细胞组兔膝关节滑膜组织IL-22、TGF-β1表达明显减少(P<0.05，P<0.01)；见表1和图2。

图1 各组兔膝关节滑膜HE染色(×400)

组别IL-10IL-22TGF-β1正常组53.5±10.12)43.6±10.42)21.7±7.12)模型组17.2±4.777.5±17.651.5±11.9软骨细胞组32.1±13.22)57.6±16.81)29.6±9.32)支架组23.4±3.91)63.1±15.126.5±11.12)支架复合软骨细胞组31.6±8.32)47.1±13.72)44.5±9.5

与模型组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

图2 各组兔膝关节滑膜IL-10、IL-22、TGF-β1免疫组化检测结果(×400)

3 讨 论

支架材料作为细胞相互作用的模板和细胞外基质的形成，为新形成的组织提供结构支持；以骨髓间充质干细胞为种子细胞具有多向分化潜能，取材简单，易分离，低免疫原性等特点，具有分化为软骨细胞、成软骨细胞、成骨细胞等骨组织细胞的能力；细胞生长因子(如TGF-β)能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化和缺损处骨组织愈合的作用〔9〕。支架结合骨髓间充质干细胞的组织工程技术在修复骨组织缺损方面已开展应用〔10〕。本研究进一步验证了组织工程在治疗RA上有良好的应用前景。

RA的主要病理改变为滑膜炎，表现为滑膜增生和炎性细胞浸润。Th17细胞在关节滑膜中主要分泌IL-17、IL-22、TFN-α等促炎因子，Treg细胞参与免疫应答的调控，主要分泌IL-10、TGF-β1等抗炎因子，通过抑制自身反应的淋巴细胞，维持机体免疫耐受，抑制炎性反应。周大兵等〔11〕发现IL-17在RA滑膜组织中的表达明显升高，IL-10在RA滑膜组织中的表达相对降低，且二者具有相关性，提示IL-17/IL-10平衡失调在RA的发病机制中具有一定作用。王秋燚等〔12〕研究发现IL-17通过相关信号转导通路，从多个方面对RA发挥致病作用。

IL-10不仅能够预防关节炎的发生，还可抑制关节炎的发展，在RA的发病过程中具有保护作用。可由肝细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等分泌，可抑制IL-1、TNF-α等促炎因子表达而发挥抗炎作用。IL-22属IL-10细胞因子家族成员，可由多种免疫细胞分泌产生，如Th1、Th22、Th17。在胶原诱导性关节炎(CIA)实验中，IL-22同时诱导促炎因子和抗炎因子产生，IL-22对早期关节炎有保护作用，其机制与增加IL-10水平有关〔13〕，提示IL-22在关节炎中具有保护及致病双重作用，取决于疾病发展的不同阶段。研究发现关节滑膜IL-22水平提高，与疾病活动性及骨破坏相关，可成为评估病情与骨破坏的指标〔14〕，提示IL-22有望成为RA治疗的新靶点。TGF-β超家族成员调节着多种细胞的生长发展过程包括细胞的生长、分化、凋亡、血管生长、细胞外的相互作用及免疫反应等〔15〕。TGF-β1是一种有双向调节能力的细胞因子，TGF-β1单独作用时，可诱导初始T细胞分化为Treg细胞，而在TGF-β1和IL-6的共同作用下可诱导初始T细胞分化为Th17细胞，TGF-β1作为一种双向调节的细胞因子，作用复杂，可能涉及RA的病程长短和病情活动度。陈瑞林等〔16〕研究发现RA患者外周血中Treg细胞占CD4+T 细胞的百分率显著低于健康对照者，且血清中TGF-β1的表达显著高于健康对照者。

综上，海藻酸钠支架复合组织工程化软骨细胞抗炎机制可能是通过上调滑膜IL-10表达，下调IL-22和TGF-β1表达起抗炎作用的。由于上述细胞因子的产生涉及多条细胞信号通路，因此，海藻酸钠支架复合组织工程化软骨细胞抗炎的具体机制与细胞因子之间是如何发挥作用的及细胞因子之间平衡失调对RA的发生发展有何影响，有待进一步研究。