HER-2与VEGF-C在胃癌组织中的表达及其相关性研究

李敏 朱家胜

胃癌（GC）是全球最常见的消化道恶性肿瘤及癌症相关死亡原因之一，其发病率、死亡率在恶性肿瘤中均排在前列。胃癌全球高发区主要集中在亚洲，而亚洲高发区又主要集中在日本及中国［1］。有统计数据显示我国胃癌新发病例占全球胃癌发病的42.6%，尽管近年来有数据显示胃癌死亡率呈现下降趋势，但其总体死亡率相比于欧美等国仍处于较高水平［2］。肿瘤的生长离不开新生的脉管系统为其提供充足的营养物质并带走代谢产物，目前研究比较多的分子标志物有血管内皮生长因子（VEGF）家族和人表皮生长因子（HER）/neu家族。VEGF-C和HER-2在肿瘤的扩散转移过程中作用显著［3］。本文探讨HER-2与VEGF-C在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌不同临床病理特征之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月至5月皖南医学院附属弋矶山医院胃肠外科61例择期行开腹胃癌D2根治术患者手术标本。根据美国癌症联合会（AJCC）于2010年颁布的第七版分期（TNM分期），Ⅰ期19例，Ⅱ期16例，Ⅲ期26例；女11例，男50例，年龄41～89岁。按年龄分为2组（≥60岁43例，＜60岁18例）；贲门及胃底18例，胃体20例，胃窦及幽门23例。

1.2 主要仪器及试剂 Pathcentre全自动密封式脱水、BMJ-Ⅲ型包埋机、电热恒温鼓风干燥机、LeicARM2135切片机、WD900B格兰仕微波炉、科龙BCD-272/HC电冰箱、即用型SP试剂盒、HER-2单抗体、VEGF-C单抗体、美国BioGenex全自动免疫组化机、Olympus BX 40光学显微镜、DAB底物显色剂、磷酸盐缓冲液 PBS（0.01M，pH7.4）、单道可调式移液器、移液器吸嘴、实验冲洗瓶、孵育盒、耐高温塑料染色架。

1.2 方法 （1）切片及光学显微镜诊断：①常规石蜡标本切片：使用LeicA-RM2135切片机，将所有石蜡包埋标本进行切片。切片厚度为5μm。每例标本制作2张切片。②上述每张标本均行常规HE染色，按胃癌组织学分类、分级标准（1981年WHO制定）进行光学显微镜诊断。（2）HER-2/neu的测定（同VEGF-C的测定）：运用免疫组织化学SP法测定HER-2/neu。具体操作方法：①脱蜡步骤：将组织片置入90℃温箱中烘片20min后；经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分别5min脱蜡；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中梯度脱水1min；再取出并缓慢流水冲洗1min。②酶的封闭与抗原修复：用高压锅预热pH8.0的EDTA抗原修复液至沸腾，放入切片，闭紧盖子，大火加热至喷气开始计时2.5min；关闭火源静置15min后流水冲洗压力锅10min冷却至室温；再经3% H2O2过氧化氢孵育10min后移入PBS液中，套圈，PBS冲洗切片；PBS 冲洗4次，每5min/次。③免疫组化染色（机器操作部分）。④封片：取出切片，流水冲洗1min，无水乙醇1min，共3次；取出风干，中性树胶封片；镜下观察，判断结果。

1.4 观察指标 （1）VEGF-C阳性细胞判定：由两位病理科专家独立观察10个高倍镜视野，棕黄色颗粒染色定位于肿瘤细胞胞质与胞膜染色。VEGF-C阳性结果根据染色程度和染色细胞百分率进行综合评分判定：①未见染色为0分，染色淡为1分，染色适中为2分，染色深为3分；②染色细胞数占所观察视野细胞数≤5%计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。最终得分计算方法为：平均着色程度得分乘以平均着色细胞所占百分率。0～1分为阴性（-），2～3分为（+），4～6分为（++），＞6分为（+++）。（+）表示弱阳性结果，（+++）表示强阳性结果。结果＞（++）判断为VEGF-C阳性。（2）HER-2阳性细胞判定：由两位主治以上职称的病理科医师独立观察10个高倍镜视野，棕黄色颗粒染色定位于细胞膜上。HER-2阳性结果判定：①“0”（阴性）指细胞膜均无染色或≤10%肿瘤细胞膜染色；②“+”（阴性）指染色肿瘤细胞＞10%，细胞膜不完整，弱染色；③“++”（不确定）指：染色肿瘤细胞＞10%，细胞基底膜和侧膜轻度至中度完整染色；④“+++”（阳性）指：染色肿瘤细胞＞10%，细胞膜基底膜和侧膜完整，强染色。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19统计软件。计数资料用χ2检验和Fisher检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HER-2阳性检出率与VEGF-C阳性检出率的比较 VEGF-C阳性表达与HER-2阳性表达无明显相关性（P＞0.05）。见表1。

表1 HER-2阳性检出率与VEGF-C阳性检出率的比较

2.2 胃癌组织中HER-2、VEGF-C与患者各临床特征的关系 见表2。

表2 胃癌组织中HER-2、VEGF-C与患者各临床特征的关系

3 讨论

胃癌在全球范围内无论是发病率还是死亡率均排在恶性肿瘤前列，是人类健康的重大威胁之一［4］。由于缺乏较完善的早期胃癌筛查指南，我国胃癌早期诊断率较低，多数胃癌确诊时已处于进展期，并发生不同程度的转移。胃癌治疗方式主要以手术联合放化疗的综合治疗为主。

VEGF在胃癌组织中其表达率与各临床特征之间的关系报道不尽相同。胃癌组织中VEGF阳性表达率约39.0%～59.4%［5］。本资料中，VEGF-C的阳性表达率为49.9%，与Xie LX等［6］用IHC法的结果报道较为接近。VEGF-C在有淋巴结转移的胃癌组织中表达显著增高。但并不是所有的VEGF-C表达阳性的病例均发生淋巴结的转移，相反也并不是所有发生淋巴结转移的病例VEGF-C阳性表达。作者认为导致该结果的可能性一种是促进淋巴结转移的途径较多，VEGF-C并不是唯一一种促淋巴管生成因子；另一种可能是VEGF-C阳性表达在淋巴结转移方面无明显促进作用或作用微弱。本资料结果表明，淋巴结转移组胃癌组织中VEGF-C表达显著增高与VEGF-C促进淋巴管生成作用有关，VEGF-C促进了淋巴管的形成，从而促进胃癌的转移，但其却不是唯一一种促进淋巴管生成的因子。VEGF-C的高表达在临床工作中对胃癌转移有预测作用，而且在胃癌的治疗、预后的判断及监测上帮助颇大。

Weiling He等［7］和Weiguo Cao等［8］的研究综合临床病理资料及随访研究发现，胃癌标本中VEGF-C表达明显增高者常预示胃癌病期晚、预后差、生存期短。本资料中Ⅱ期与Ⅲ期之间的结论与Weiling He等和Weiguo Cao等相符，其他各期之间需要进一步增大样本量研究才可得出结论。

HER家族在促进肿瘤细胞增殖、促进肿瘤进展与转移等方面作用显著。各研究报道中免疫组化法检测胃癌组织中HER-2阳性表达率在6.8%～34.0%［9］。较多报道称HER-2表达阳性率与胃癌分型（Lauren分型）有显著相关性。美国临床肿瘤学会（ASCO）于2014年公布的中国胃癌患者HER-2表达与病理分型关系显示，HER-2表达阴性患者生存期最好，而弥漫型生存期最差。关于肿瘤位置与HER-2阳性率的关系各方报道尚存在争议，大部分学者报道其与位置无相关性［10］。

本资料，HER-2阳性表达率为11.5%，与其他大部分研究报道相比阳性率偏低。分析其原因可能为：本实验中选取病例61例，样本量有限；实验过程中某些操作可能导致结果出现偏差；检测技术的误差，IHC检测结果灵敏度不够。HER-2阳性表达率与上述临床病理特征之间无明显相关性，与大部分研究报道比较相符。关于其表达率与Lauren分型之间、及与预后的关系缺乏进一步跟进、随访资料，未能在该处得出结论。

胃癌的靶向治疗已然成为当前胃癌治疗的热点。HER-2与VEGF-C在胃癌组织中过表达对胃癌的靶向治疗提供理论依据。有报道称HER-2的过度表达通过一些特殊机制上调VEGF的表达水平，并且在HER-2过表达胃癌患者的治疗中联合抗HER-2和抗VEGF效果明显好于单纯抗HER-2治疗［11］。假设两者间确实存在必然联系，将给胃癌的治疗带来更加有效的方法。本资料中未发现VEGF-C与HER-2之间的相关性，考虑可能与样本量小有关，如继续探究两者之间的关系必须增大样本含量，收集更多跟进随访资料。