IL-12和TGF-β1在非急性硬膜下血肿内的表达及血肿形成时间推断中的法医学意义

杜 宇，任 鹏，单 迪，贾儒林

（中国刑事警察学院 法医系，辽宁 沈阳110035）

硬膜下血肿（subdural hematoma，SDH）是法医学鉴定工作中常见的颅内血肿，多由外伤造成。根据临床起病缓急分为急性、亚急性及慢性，伤后3 d至3周出现症状者为亚急性硬膜下血肿，3周以上者为慢性。亚急性和慢性硬膜下血肿（以下统称为非急性硬膜下血肿）进程缓慢，外伤后经历一段时间才呈现相应症状，因此与外伤的关联性成为法医鉴定的难点问题。目前并无推断非急性硬膜下血肿形成时间的有效方法。非急性硬膜下血肿的发病机制尚未形成统一共识，但研究认为，局部炎症反应，血肿外膜新生血管生成及再出血与非急性硬膜下血肿的发生发展关系密切[1-5]。

本研究选择促炎性细胞因子白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和促进新生血管生成和组织纤维化的转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作为观察对象，检测这两种细胞因子在非急性硬膜下血肿液中的含量变化，探讨利用细胞因子推断硬膜下血肿形成时间的可行性。

1 材料与方法

1.1 对象及分组

选取2014年9月—2016年9月间的非急性硬膜下血肿患者30例，其中男26例，女4例；年龄46～73 岁，平均（64±7.3）岁；23 例有明确外伤史；6例伴有颅骨骨折。

影像学检查初次发现血肿时，血肿量估算不超过10 mL，神经系统症状无或轻微，依据临床症状及CT或MRI检验结果的变化证实血肿为慢性进程，随病程发展，神经系统症状逐渐加重，最终采取局麻下颅骨钻孔冲洗引流术抽取血肿，术前估算血肿量50～100 mL。初次发现血肿至神经症状出现的时间间隔超过3 d，初次发现血肿至钻孔冲洗引流术的时间间隔超过7 d，均为单侧幕上血肿；患者术前凝血功能正常，未使用影响凝血、纤溶的药物，术前2月内无急慢性感染性疾病史；颅脑以外器官及组织无轻伤（含）以上程度损伤。纳入患者的病程最短7 d，最长 64 d，平均（31±7）d。 依据初次发现血肿至手术之间时间间隔将病例分为3组（血肿组），A组：7～14 d；B 组：15～21 d；C 组：22 d 以上。

1.2 检材采集

所有病例均在局麻下行颅骨钻孔冲洗引流术，术中收集未冲洗前抽出的血肿液10 mL和患者静脉血3mL备检。同年龄段的10名志愿者（8男，2女，凝血功能正常，未使用影响凝血、纤溶的药物，近期无感染性疾病史）分别空腹抽取静脉血3 mL（健康外周血对照组）。所采静脉血均置于3.2%枸椽酸钠抗凝（1：9）真空采血管，离心半径 4 cm，3 000 r/min，离心10 min，分离得到血清。全部检材-80℃冰箱低温保存备检。

本研究符合患者所在医院人体试验委员会所制定的伦理学标准，得到批准予以实施，并与患者家属及自愿者签署实验知情同意书。

1.3 检测方法

采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血肿液及静脉血中IL-12和 TGF-β1含量。IL-12 （P40）（h）ELISA kit（武汉博士德生物工程有限公司），TGF-β1 ELISA kit（上海信帆生物科技有限公司），采用意大利SD11/XT-96MB酶标仪，操作均严格按照仪器和ELISA检测试剂盒说明要求进行，绘制标准曲线，计算出IL-12、TGF-β1表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS16.0软件分析，测定结果用均数±标准差（±s）表示；采用t检验；P＜0.05 视为差异有显著性。

2 结果

与健康志愿者外周血内IL-12、TGF-β1的含量相比较，硬膜下血肿患者的血肿内和外周血内IL-12、TGF-β1含量均显著提高。

血肿内IL-12含量随血肿形成时间延长而下降，A组（硬膜下血肿形成7～14 d）最高，B组（硬膜下血肿形成15～21 d）和C组（硬膜下血肿形成22 d以上）逐渐降低，分别是同组患者外周血内IL-12含量的 19.5、14.1、11.0 倍，各血肿组之间比较差异显著（P＜0.01）。血肿患者外周血IL-12含量组间差异不明显（P＞0.05）。

血肿内TGF-β1含量随血肿形成时间延长而逐渐增加，A组最低，C组最高，分别是同组患者外周血内 TGF-β1 含量的 21.1、54.8、94.4 倍，各血肿组之间比较差异显著（P＜0.01）。 血肿患者外周血TGF-β1 含量组间差异不明显（P＞0.05）。 血肿和静脉血IL-12和TGF-β1含量变化详见表1。

表1 非急性硬膜下血肿患者血肿液和外周血内IL-12和TGF-β1含量变化x±s

3 讨论

非急性硬膜下血肿的发生与症状出现具有一定的时间间隔，因此容易引发血肿与争议外伤之间是否存在关联的争议，相关检案成为法医学鉴定的疑难问题。如果能对非急性硬膜下血肿形成时间进行估算将有助于血肿成因的推断工作。但是，目前尚没有关于非急性硬膜下血肿形成时间推断的相关研究。

炎症反应、新生血管生成和纤维化是损伤发展过程中必不可少的病理过程。随着分子生物学发展，与炎症反应、新生血管生成、纤维化关系密切的细胞因子越来越多的被应用于损伤时间推断[6-8]。虽然非急性硬膜下血肿的发生、发展机制仍不明确，但局部炎症反应、血肿外膜新生血管的形成及再出血在解释血肿发病机制方面逐渐为人们所接受，与炎症反应和新生血管生成相关联的细胞因子在慢性硬膜下血肿内高表达已经被证实[3-5，9-12]。炎症反应和新生血管生成、纤维化分别在损伤后的不同时段占优势，因此我们设想与相应生物学作用密切相关的细胞因子在硬膜下血肿内的表达可能呈现规律性，可作为血肿形成时间推断的指标。

IL-12是具有多种免疫调节功能的促炎症性细胞因子，在多种损伤和疾病的炎症反应阶段发挥作用。TGF-β1是一种多功能细胞因子，能促进新生血管生成，促进组织纤维化[13]。酶联免疫吸附法（ELISA）已经成为研究创伤、疾病等病理过程中某些细胞因子含量变化的重要技术手段，其检测结果较之免疫组化等法医学传统的形态学观察方法具有更高的灵敏度和准确性。

本研究检测非急性硬膜下血肿及外周静脉血中IL-12、TGF-β1含量的变化。结果显示，与健康志愿者外周血内IL-12、TGF-β1的含量相比较，硬膜下血肿患者血肿内和外周血内IL-12、TGF-β1的含量均显著提高。这进一步证实局部炎症反应，血肿外膜新生血管生成及再出血是非急性硬膜下血肿的发生、发展的重要机制，而 IL-12、TGF-β1可能是相关病理进程中的关键因子。

血肿内IL-12含量随血肿形成时间延长而下降，血肿形成7～14 d组最高，之后逐渐降低，分别是同组患者外周血内 IL-12 含量的 19.5、14.1、11.0倍，各组之间差异显著（P＜0.01）。 与之相反，血肿内TGF-β1含量随血肿时间延长而逐渐增加，分别是同组患者外周血内 TGF-β1 含量的 21.1、54.8、94.4倍，各组之间同样差异显著（P＜0.01）。 上述变化规律为硬膜下血肿形成时间推断提供了可能。同时，IL-12、TGF-β1不同的含量变化规律提示局部炎症反应可能是硬膜下血肿发生和发展的早期机制，而新生血管的形成及再出血可能在非急性硬膜下血肿发展的中晚期起作用。

血肿患者较之健康自愿者外周血内IL-12，TGF-β1 含量均显著增高（P＜0.01），但各时间组之间无统计学差异，从这一结果看，全身性的细胞因子含量变化尚无法应用于损伤时间推断，而创伤局部组织内细胞因子的变化更具有法医学意义。

硬膜下血肿发生、发展的研究尚无法通过统一的动物建模实现，因此符合实验构想的病例样本和检材收集成为目前研究的关键。本研究在检材收集过程中尽量避免各种可能的干扰因素，力求实验样本的标准、统一。我们将初次发现血肿至手术之间的时间间隔假定为血肿形成时间，并据此分组，而对于血肿发生至初次检出之间的时间尚无法评估。本研究首次尝试通过血肿内细胞因子含量的变化推断硬膜下血肿形成时间，实验结果提示具有深入研究的价值，将更多的细胞因子纳入检测范围，并且更加精细地进行时间分组将成为未来研究工作的重点。