花溪古茶树离体繁殖技术研究初报

陈立杰，杨 霞，高 倩，李 悦，陈 红

（1. 贵州大学 校办产业总公司，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；3. 贵州大学 科技学院，贵州 贵阳 550025）

贵州是世界茶树原产地之一，有着丰富的茶树资源。通过调查发现，贵阳市花溪区的久安、高坡等乡镇有数百棵古茶树资源，古茶树因其进化上的原始性、极强的抗逆性、丰富的遗传基因，成为研究茶树起源、演化和分类的重要材料和依据。为了加强对古茶树资源的保护和开发利用，可对花溪优良古茶树进行离体快速繁殖。对茶树的组织培养，既可用于大量生产优良无性系植株，又可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和等障碍，对于开展茶树种质资源的保存、新品种的培育及种性改良等具有重要意义。因此，本研究以花溪古茶树为试验材料，初步探讨并建立其组培快繁体系，为花溪古茶树资源的保存及推广利用提供材料和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为贵州省贵阳市花溪区高坡乡、久安乡的古茶树。其中高坡乔木型古茶树4个单株代号分别为HGL、HJ（J）、HGK、HGN；久安灌木型古茶树4个单株代号分别为U、10301、06721、20298。试验均选取古茶树优良单株带芽茎段。

1.2 试验方法

1.2.1 花溪古茶树外植体灭菌时间筛选选取久安灌木型花溪古茶树当年生幼嫩枝梢，去除叶片后保留小段叶柄，然后将其用流水冲洗2 h，将冲洗过的久安灌木型古茶树单株10301用0.1% HgCl2分别消毒4、6、8 min，找到最佳消毒时间。将2种类型花溪古茶树8个单株均以最佳消毒时间进行消毒后，用无菌水冲洗5次，切取1 cm长的茎段作为外植体。7 d后观察并记录数据，计算污染率、褐变率及存活率。比较最佳消毒时间下，不同品种花溪古茶树茎段的差异，找到成活率最高的花溪古茶树单株。

1.2.2 6-苄基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）配比试验选取1.2.1中所得成活率最高的花溪古茶树单株无菌茎段为代表，接种于添加有不同质量浓度6-BA（0、0.5、1、1.5、2 mg/L）和NAA（0、0.1、0.2、0.5、1 mg/L）组合的MS培养中，40 d后观察统计各处理组培苗萌发生长情况、增殖系数。

1.2.3 生根培养基筛选将1.2.2中生长健壮的芽苗接种到附加有2 mg/L活性炭以及不同质量浓度的吲哚丁酸（IBA）（0.5、1、2 mg/L）和NAA（0.1、0.5、1 mg/L）的1/2 MS培养基中进行生根培养。40 d后统计生根情况。

1.3 培养条件

培养温度为（25±2）℃，光周期为14 h/d，光照强度约为2 000 lx。

1.4 数据处理

试验数据均采用Excel进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对花溪古茶树茎段的影响

由表1可知，不同消毒时间对久安灌木型古茶树单株10301茎段的污染率、褐变率、成活率影响差异显著。随着消毒时间的增加，污染率逐渐降低，成活率逐渐增加，但褐变率整体也随之增加。综合考虑污染率、褐变率和成活率，以0.1% HgCl2消毒6 min为宜，此时花溪古茶树单株10301茎段的污染率、褐变率及成活率分别为25.7%、20.0%及52.3%。

表1 不同消毒时间对花溪古茶树茎段的影响

2.2 同一消毒时间对不同品种花溪古茶树茎段消毒效果的影响

由表2可知，采用0.1% HgCl2消毒6 min时，高坡乔木型古茶树4个单株中成活率最高的为HGN，其成活率可达60.0%；久安灌木型古茶树4个单株中褐变率均比高坡乔木型古茶树低，成活率也较高，其中最高的是单株10301，存活率为73.3%。

表2 同一消毒时间对不同品种花溪古茶树茎段的影响

2.3 不同培养基组合对花溪古茶树萌发生长及增殖的影响

由图1可知，不添加任何生长剂的培养基中，久安灌木型古茶树单株10301茎段几乎无变化，但添加生长剂培养基中的茎段均产生一定变化，表明激素配比对茶树茎段萌发生长及增殖有明显的影响。由表3可知，在培养基中添加不同质量浓度的生长剂可使久安灌木型古茶树单株10301茎段的增殖系数增高，其中变化最明显的为处理6（6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L），其培养基中久安灌木型古茶树单株10301茎段长势好，粗壮，增殖系数最大（1.5）。虽然处理7（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L）的培养基中久安灌木型古茶树单株10301茎段生长也相对较好，但综合增殖及生长情况，最适宜花溪古茶树茎段萌发生长及增殖的培养基组成为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

图1 不同培养基对花溪古茶树茎段萌发的影响

表3 不同6-BA和NAA质量浓度培养基组合对花溪古茶树生长及增殖的影响

2.4 不同培养基组合对花溪古茶树生根的影响

当久安灌木型古茶树单株10301茎段的不定芽长至2 cm以上时，选取生长健壮的试管苗，转接到生根培养基上进行诱导生根。由表4可知，IBA和NAA质量浓度过高或过低组合的培养中，花溪古茶树生根率均较低，培养基组成为1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA的生根率最高（56.7%），此时苗株粗壮，长势良好（图2），与其他处理存在显著差异。

表4 不同IBA和NAA质量浓度培养基组合对花溪古茶树生根的影响

图2 培养基组成为 1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA 的花溪古茶树苗株时生长状况

3 结论与讨论

一般情况下，茶树组织的培养常采用75%酒精与0.1% HgCl2进行消毒。但在本试验前期的消毒处理中发现，酒精会增加花溪古茶树幼嫩茎段的褐变率。此外，有研究表明，植株的外植体木质化的程度越高，越不容易进行消毒，茎段所受的污染越严重。本试验结果显示，以0.1% HgCl2消毒6 min为宜，此时花溪古茶树单株10301茎段的污染率、褐变率及成活率分别为25.7%、20.0%及52.3%，但仍不是理想状态，因此后期还需进一步对花溪古茶树离体培养的消毒方式进行探讨。

在花溪古茶树茎段的萌发增殖培养中，生长剂含量的增加对茎段生长及增殖有一定促进作用，但超过一定范围后，会抑制茎段的萌发生长。本试验所得最优的培养基组成为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，此时花溪古茶树的茎段芽苗粗壮，长势好，但增殖系数偏低，因此还有待对花溪古茶树增殖培养基作进一步优化。

此外，由于花溪古茶树乔木和灌木2种类型的优良单株较多，本试验中仅对个别优势单株进行离体繁殖，因此，为了更好的保护和利用花溪古茶树优良资源，还需对不同花溪古茶树离体繁殖技术体系进行系统优化。