m iR-451对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞增殖及炎症反应的影响

熊金河，吴 霞，苟玉潇

遂宁市中心医院风湿免疫科四川遂宁629000

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性自身免疫性疾病，表现为多关节的滑膜慢性炎症［1］。microRNA(miRNA)是由21 ～24 个核苷酸组成的非编码短链内源性单链微小RNA，参与基因表达的调控［2］，在多种生理过程中发挥重要作用［3-4］，与多种疾病的发生发展关系密切，包括癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病及心血管疾病等［5］。近年来，众多学者［6-7］报道了RA 患者和动物模型中异常表达多种 miRNA。体外研究［8］表明，miR-451可以在一定条件下调节树突状细胞细胞因子的分泌能力。本研究对RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中 miR-451的表达进行了检测，并观察过表达miR-451、激活NF-κB信号通路对RA患者PBMC细胞增殖、炎症反应的影响，揭示 miR-451、NF-κB信号通路与RA的关系。

1 材料与方法

1．1 材料 RPMI 1640培养基、胎牛血清、MTT均购自上海碧云天生物技术有限公司;Lipofectamine2000、BCA蛋白定量试剂盒、RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、ECL发光液和RIPA裂解液购自大连TaKaRa公司;miR-451模拟物(mimics)及模拟物阴性对照物(NC)购自广州市锐博生物科技有限公司;qRT-PCR试剂盒购自上海钦诚生物科技有限公司;人白介素17(IL-17)、IL-1β、IL-6检测试剂盒均购自上海恒远生物科技有限公司;PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司;NF-κB信号通路特异性激活剂TNF-α购自上海艾博抗公司。

1．2 PBMC的分离培养 选取在我院通过28个关节疾病活动指数(disease activity score 28 joint，DAS28)、临床疾病活动指数(clinical disease activity index，CDAI)、简化疾病活动指数(simplified disease activity index，SDAI)确诊为低活动度RA的患者20例，患者在1个月内均未服用免疫抑制剂或糖皮质激素类药物。另选取同期健康志愿者5人。空腹抽取受试者静脉血，肝素抗凝，参考安燕等［9］的方法分离全血中的PBMC，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。将分离的健康志愿者和RA患者的PBMC分别记为正常PBMC、RA-PBMC。

1．3 实验分组 将RA-PBMC分为对照组(正常培养)、miR-451组(转染 miR-451 mimics)、miR-NC 组(转染 NC)、miR-451+TNF-α 组(用 10 μg/L 的TNF-α处理转染 miR-451 mimics的 RA-PBMC 24 h)。转染操作均按照脂质体Lipofectamine2000试剂盒说明书进行，转染8 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h。

1．4 观察指标

1．4．1 细胞中miR-451的表达 采用qRT-PCR法检测。收集细胞并调整密度至106个/mL，取1 mL用RNA抽提试剂盒提取总RNA，然后用反转录试剂盒合成cDNA;以cDNA为模板进行PCR。按照PCR试剂盒的要求操作，以U6作为内参。配制20 μL的反应体系:依次添加 10μL的2×SYBRmix，上、下游引物各 1 μL，1 μL的 cDNA、7 μL的ddH2O，充分混匀。反应条件为95℃30 s，95℃ 15 s，72 ℃ 15 s，进行 40 个循环。用 2－ΔΔCt计算 miR-451的相对表达水平。miR-451上游引物序列5’-GCGGCGCAAAGAATTCTCCT-3’，下游引物序列 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6上游引物序列5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

1．4．2 细胞增殖抑制率 采用MTT法检测。收集细胞并调整密度至104个/mL，接种至96孔板，每孔加MTT溶液(5 g/L)20μL，孵育4 h，终止培养，弃去培养液上清，每孔加150μL DMSO，振荡使结晶充分溶解，在490 nm波长下检测吸光度(A)。细胞增殖抑制率=［1－样品A/空白A］×100%。

1．4．3 细胞中 IL-17、IL-1β、IL-6的表达 采用ELISA法检测。收集细胞，于4℃12 000 r/min离心10 min，取上清，按照试剂盒要求检测 IL-17、IL-1β、IL-6的含量。

1．4．4 细胞中 P65、P52、P50、IκBα 蛋白的表达

采用Western blot法检测。将对数生长期的细胞用2．5 g/L胰蛋白酶缓慢消化，然后收集细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。将配制好的浓缩胶和分离胶分别缓缓倾倒凝固后，进行稳压和稳流电泳。电泳结束后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜，用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，洗膜，加入兔抗人P65或P50多克隆抗体(1∶500，圣克鲁斯生物公司)、P52多克隆抗体(1∶1 000，上海研盟生物公司)、IκBα 多克隆抗体(1∶500，艾美捷科技公司)和GAPDH单克隆抗体(1∶1 000，上海碧云天生物技术有限公司)，4℃过夜孵育，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，4℃ 2 h。ECL发光，曝光。用凝胶成像系统采集图像，用Image J分析条带灰度值，以目的条带与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1．5 统计学处理 采用SPSS 21．0进行数据分析。正常PBMC和RA-PBMC上述指标的比较采用两独立样本的t检验;4组上述指标的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验;检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 RA-PBMC中m iR-451、炎症因子的表达及增殖抑制率的比较 见表1。RA-PBMC细胞增殖抑制率，miR-451及 IL-17、IL-1β、IL-6表达均高于正常PBMC(P ＜0．05)。

表1 正常PBMC和RA-PBMC中m iR-451、炎症因子表达及增殖抑制率的比较

2．2 TNF-α 对过表达 m iR-451的 RA-PBMC 中m iR-451炎症因子表达及增殖抑制率的影响 见表2。与对照组和miR-NC组相比，miR-451组细胞中miR-451表达、细胞抑制率升高，IL-17、IL-1β、IL-6表达降低(P＜0．05)。与miR-451组比较，miR-451+TNF-α组miR-451表达和细胞增殖抑制率降低，IL-17、IL-1β、IL-6 的表达均升高(P ＜0．05)。

表2 4组细胞中m iR-451、炎症因子表达及细胞增殖抑制率的比较(n=9)

2．3 TNF-α 对过表达 m iR-451的 RA-PBMC 中P65、P52、P50及IκBα蛋白表达的影响 见图1和表3。与对照组和miR-NC组相比，miR-451组细胞中 P65、P52、P50 蛋白表达均下调，IκBα 蛋白表达上调(P＜0．05)。与miR-451组相比，miR-451+TNF-α 组细胞中 P65、P52、P50蛋白表达上调，IκBα 蛋白表达下调(P ＜0．05)。

图1 4组细胞中P65、P52、P50及IκBα蛋白的表达

表3 4组细胞中P65、P52、P50及IκBα蛋白的表达(n=9)

3 讨论

miRNA在人类多种疾病的发生发展中均具有调控作用，包括癌症、自身免疫疾病、神经退行性疾病及心血管疾病等［5］。有研究［10］报道 miR-451在关节痛患者中的表达异常升高。Churov等［11］报道，RA患者血清miR-451表达水平升高，有可能成为RA的早期诊断指标。Wang等［12］报道，过表达miR-451的滑膜成纤维细胞增殖能力降低，细胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平降低，并认为miR-451通过下调P38 MAPK的表达而降低滑膜成纤维细胞的增殖能力和炎症细胞因子的表达。

NF-κB是由Rel蛋白家族成员之间相互作用构成的一种二聚体，又称Rel同源结构域。在哺乳动物中，Rel蛋白包括 RelA(P65)、RelB、c-Rel、NF-κB2(P52)、NF-κB1(P50)［13-14］。大量研究［15-16］报道，NF-κB信号通路在RA炎症反应过程中异常激活，促进了病情的发展，miR-125b、miR-138和LncRNA HOTAIR均可通过NF-κB信号通路调节RA的进展。

本研究结果显示，RA患者PBMC细胞中miR-451高表达，与Churov等的实验结果相一致;过表达miR-451可明显减弱RA患者PBMC细胞的增殖能力和炎症因子的分泌，这说明miR-451对RA患者PBMC细胞也具有调节作用。本研究结果还显示，过表达miR-451可下调RA患者PBMC中NF-κB信号通路相关蛋白 P65、P52、P50的表达，上调 IκBα的表达，提示过表达miR-451抑制了RA患者PBMC中NF-κB信号通路，推测miR-451对RA患者PBMC细胞增殖、炎症反应的调控可能与该通路相关。进一步研究发现，利用TNF-α激活NF-κB信号通路后，过表达miR-451的RA患者PBMC细胞中miR-451的表达明显下调，细胞增殖抑制率也降低，细胞中炎症因子的表达上调，这说明激活NF-κB信号通路可抑制miR-451的表达，从而增强了RA患者PBMC细胞的殖能力，调节炎症因子的表达。

综上所述，miR-451可抑制RA患者PBMC的增殖能力和炎症反应，其机制与NF-κB信号通路失活有关，miR-451有可能成为RA治疗的靶点。