程序性细胞死亡因子4过表达对增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的影响

潘学洪，李爱武，李新华

1)潍坊市益都中心医院医学美容科山东潍坊262500 2)山东大学齐鲁医院小儿外科济南250012 3)山东医学科学院糖尿病医院检验科济南250000

成纤维细胞是形成瘢痕的重要原因［1］。程序性细胞死亡因子 4(programmed cell death 4，PDCD4)是一种细胞死亡因子，参与调控细胞生长过程，在骨骼肌、心、肺等组织中均有表达［2］。研究［3］显示，PDCD4与成纤维细胞的凋亡、分化、胶原合成等有关，其在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达水平低于正常皮肤成纤维细胞。本研究分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞，通过细胞转染的方法过表达PDCD4，探讨PDCD4在增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡中的作用，为研究病理性瘢痕的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 增生性瘢痕组织标本取自潍坊市益都中心医院，标本采集已获患者知情同意，患者术前未接受过治疗。pEGFP-PDCD4真核过表达载体及空载体pEGFP由潍坊市益都中心医院整形外科实验室构建保存，Lipofectamine2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，cDNA合成试剂盒购自美国Thermo公司，PDCD4、β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，荧光定量PCR试剂盒购自美国Biomiga公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Sigma公司，PDCD4、PTEN、Bax、Bcl-2 多克隆抗体均购自美国Abcam公司，TUNEL凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1．2 增生性瘢痕成纤维细胞的分离培养 取增生性瘢痕组织，用含青链霉素的PBS洗涤3次，用眼科剪剔除皮下组织和表皮组织，再用含青链霉素的PBS 洗涤3 次，剪碎(大小约0．5 mm3)，加入2．5 g/L的胰蛋白酶，4℃消化9 h。取消化后的组织块接种于细胞培养瓶中，翻转培养瓶使组织块朝下，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育6 h，取出培养瓶，翻转，使组织块朝上，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。期间每隔3 d换液一次，待细胞汇合形成集落后，用2．5 g/L的胰蛋白酶消化传代。分离培养的细胞经免疫组化染色发现角蛋白19抗体染色阴性，波形蛋白抗体染色阳性，确认为成纤维细胞。取第4代细胞用于后续实验。

1．3 细胞转染及分组 将增生性瘢痕成纤维细胞接种到6孔板中，每孔4×105个细胞，培养1 d后，进行细胞转染。将Opti-MEM预热1 h后加入上述细胞培养板中，每孔加入1．5 mL。再将用 Opti-MEM稀释好的Lipofectamine2000和pEGFP-PDCD4、pEGFP分别混合后室温孵育20 min，加入细胞培养板中，每孔加入500μL，孵育6 h，更换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM，继续培养72 h，用于后续实验。将转染pEGFP-PDCD4和pEGFP后的增生性瘢痕成纤维细胞记为pEGFP-PDCD4组和pEGFP组，以未转染细胞为空白对照组。

1．4 qRT-PCR检测PDCD4水平 3组细胞培养72 h后，加入1 mL Trizol提取RNA，检测纯度后反转录成cDNA，采用荧光定量PCR检测PDCD4水平。β-actin上游引物为5’-CTGGGACGACATGGA CAAAA-3’，下游引物为5’-AAGGAAGGCTGGAAG TGTGC-3’。PDCD 4上游引物为5’-GGCAAGGA GGGACAGAAA-3’，下游引物为 5’-CCCAAAGCA CAGTATCTCAACA-3’。PCR反应体系共20μL，包括10．0μL SYBR Primer Ex Taq TM Ⅱ(2×) ，上、下游引物各 1．0 μL，4．0 μL cDNA 样本混合液和4．0μL无RNase dH2O。扩增条件:95℃预变性5 min;95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环。以β-actin为内参，采用2－ΔΔCt法计算PDCD4 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

1．5 W estern blot法检测 PDCD4、PTEN、Bax、Bcl-2水平 3组细胞培养72 h后，收集细胞，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，4℃，12 000×g离心5 min，吸取蛋白上清液，用BCA法对蛋白定量。取蛋白样品加入等体积的上样缓冲液，100℃孵育5 min。电泳后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。丽春红染色5 min，加入50 g/L脱脂奶粉37℃平摇2 min。加入按1∶600 稀释的 PDCD4、PTEN、Bax、Bcl-2多克隆抗体，4℃反应过夜后，加入按1∶3 000稀释的二抗，37℃孵育2 h。化学发光，显影，定影。用扫描仪扫描图片，Quantity one分析条带灰度值，以β-actin为内参，分析目的蛋白表达水平。实验重复3次。

1．6 生长曲线测定 将3组细胞接种到24孔板中，每孔104个细胞，分别在第 1、2、3、4、5 天用 2．5 g/L的胰蛋白酶消化，台盼蓝染色分析活细胞数量，以测定时间为横轴，以每mL含有的细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。每组设3个复孔，实验重复3次。

1．7 MTT法检测细胞增殖活性 将3组细胞接种到24孔板中，每孔2×104个细胞，培养72 h后，每孔加入pH 7．4的 MTT溶液20μL，37℃孵育4 h后，吸弃上清液，加入150μL的二甲基亚砜溶液，振荡反应10 min，观察到蓝紫色结晶溶解后，检测570 nm波长处的光密度值，代表细胞增殖活性。实验重复3次。

1．8 TUNEL法检测细胞凋亡 3组细胞培养72 h后，制作细胞爬片，用PBS洗涤3次，加入体积分数0．2%的 TritonX-100处理5 min后，用 PBS洗涤2次，加入20 mg/L蛋白酶K溶液，室温下孵育30 min。于含体积分数3%牛血清白蛋白、20%胎牛血清的TBS中，室温条件下孵育30 min，用PBS洗涤2次，加入FITC标记的TUNEL溶液，置于湿盒内37℃孵育60 min。PBS洗涤2次后，在显微镜下观察，选取5个视野，先用200倍的暗视野计数细胞总数，后用荧光显微镜观察阳性细胞数目，计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1．9 统计学处理 采用SPSS 21．0处理数据，3组间PDCD4表达水平、光密度值、凋亡率以及PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 3组细胞PDCD4表达水平的比较 结果见图1和表1。与空白对照组、pEGFP组相比，pEGFPPDCD4组细胞PDCD4的表达水平升高。

图1 3组细胞PDCD4表达水平的比较

表1 3组细胞PDCD4表达水平的比较(n=3)

2．2 3组细胞生长曲线比较 结果见图2。与空白对照组、pEGFP组相比，pEGFP-PDCD4组细胞生长速度降低。

2．3 3组细胞增殖活性和凋亡率比较 结果见表2。与空白对照组、pEGFP组相比，pEGFP-PDCD4组细胞光密度值降低，凋亡率升高。

2．4 3组细胞 PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的比较 结果见图3和表3。与空白对照组、pEGFP组相比，pEGFP-PDCD4组细胞PTEN、Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低。

图2 细胞生长曲线

表2 3组细胞增殖活性和凋亡率比较(n=3)

图3 3组细胞PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的比较

表3 3组细胞PTEN、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的比较(n=3)

3 讨论

PDCD4位于10q27染色体上，其编码的蛋白能够与脯氨酸激酶、蛋白激酶C等结合，含有多个磷酸化位点，由469个氨基酸组成，在其氨基端有两个MA3螺旋结构域，能够与真核细胞中翻译起始因子eIF4A结合，阻碍细胞内蛋白质合成和核糖体复合物的形成，发挥促进细胞凋亡的作用［4-6］。研究［7-8］显示，PDCD4不仅参与机体正常的生理过程，还与癌症、心肌病、糖尿病、病理性瘢痕形成等有关。彭燕［9］在研究miR-21对病理性瘢痕成纤维细胞生长中的作用时发现，PDCD4在病理性瘢痕细胞中表达下调，并且可能参与成纤维细胞的生长过程。后续的研究［10-11］发现，miR-21表达下调后，增生性瘢痕成纤维细胞PDCD4表达水平升高，增殖受抑。上述研究表明，PDCD4可能参与调控病理性瘢痕的形成，并且与增生性瘢痕成纤维细胞增殖有关。

本研究首先体外分离培养了人增生性瘢痕成纤维细胞，转染PDCD4后，经qRT-PCR和Western blot法验证成功构建了PDCD4过表达的增生性瘢痕成纤维细胞。细胞生长曲线显示，过表达PDCD4的增生性瘢痕成纤维细胞从第3天开始活细胞的数量较空白对照组和pEGFP组降低，增殖活性降低，说明PDCD4抑制了增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，这与之前的研究［10-11］结果一致。

病理性瘢痕组织的形成除了与成纤维细胞过度增殖有关，还与成纤维细胞凋亡减少有关。细胞凋亡的发生是一个主动过程，是受多种基因严格调控的程序性死亡过程，与细胞内凋亡蛋白有关［12-13］。Bcl-2蛋白家族参与调控细胞凋亡过程，根据其作用不同可以分为抗凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，而 Bax是一种促凋亡蛋白［14］。PTEN编码的蛋白具有双重的磷酸酶活性，能够与细胞内多种信号通路交叉作用，调控细胞的生长、黏附、转移、凋亡等过程［15-16］。研究［9，17］显示，在病理性瘢痕组织中，PTEN表达下调，并且能够诱导成纤维细胞凋亡，而PDCD4也在病理性瘢痕组织中表达下调，二者之间可能存在一定的作用。本研究结果显示，PDCD4过表达的增生性瘢痕成纤维细胞凋亡率升高，细胞中Bax和PTEN表达水平升高，Bcl-2表达水平下降，说明PDCD4可能通过作用于PTEN影响细胞凋亡过程，而两者的相互调节作用仍然需要在后续实验中验证。

综上，PDCD4过表达可抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，诱导细胞凋亡，机制可能与上调细胞中PTEN、Bax表达，下调Bcl-2表达有关。本研究结果对于探讨病理性瘢痕的发病机制具有重要意义，为继续探讨PDCD4在增生性瘢痕成纤维细胞生长中的作用奠定了基础。