胃腺癌中ceRNA网络的构建和m iR-204-5p、HOXC8基因的表达及其相关性检测

王 蕾，任凯凯，马佳康，陈小华，张萌迪，李丹丹，李晓娜，马 军

1)郑州大学第二附属医院消化疾病研究所郑州450014 2)郑州大学第二附属医院肿瘤科郑州450014 3)漯河市中心医院消化内科河南漯河426499 4)郑州大学第二附属医院放射科郑州450014 5)郑州大学第二附属医院检验科郑州450014

胃癌的发生、发展与遗传、环境及细菌感染有关，据2018年报道的统计数据，全球胃癌分别位于恶性肿瘤发病率的第5位、死亡率的第2位，提示胃癌的恶性程度较高且预后不佳［1］。胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一。通过更多的分子特征的研究，有助于了解胃癌的发生发展机制，探索更为有效地诊疗靶点。近几年来，非编码RNA的功能逐渐被大家所认识，包括长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)等。miRNA是一类长为21～23个核苷酸的非编码小RNA分子，通过基因转录后调控与抑制靶基因的表达等途径来发挥作用。lncRNA又可作为竞争性内源RNA(ceRNA)调控相关miRNA的功能，形成细胞内复杂的调控网络。文献［2-5］报道，有300余个miRNA和胃癌有关，其中miR-204-5p在胃癌中低表达，和胃癌的发生发展关系密切。本研究利用TCGA数据库构建了胃腺癌ceRNA网络，分析重要节点基因 miR-204-5p及其靶基因HOXC8在胃腺癌中的表达情况，为研究胃腺癌的发生发展机制奠定基础。

1 材料与方法

1．1 TCGA数据分析和ceRNA网络构建 从TCGA 数据库(https://cancergenome．nih．gov/)中下载胃腺癌 mRNA和 miRNA测序数据(版本2018．2．23)，使用R语言“edgeR”包筛选差异表达基因，筛选条件为差异倍数＞2且校正P值＜0．05。利用miRcode、starBase、miRDB、miRTarBase、TargetScan 等数据库和在线工具，预测差异表达基因的靶向调节关系，构建lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络，利用Cytoscape V3．5．1软件进行作图。

1．2 病例收集 收集郑州大学第二附属医院初诊初治的胃腺癌手术标本32例，其中男23例，女9例，患者年龄(57±14)岁，均经病理证实。同时收集癌旁正常黏膜组织(手术切缘取材，距癌组织＞5 cm，且经病理证实)。标本液氮速冷后存于－80℃冰箱备用。

1．3 细胞系和主要试剂 胃腺癌SGC7901细胞系(ATCC)为本实验室保存。Trizol(15596018)、miRNA反转录试剂盒(G903;含加polyA尾酶)、mRNA反转录试剂盒(G492)均购自 Ambion公司，qRTPCR试剂为含ROX的SYBRGreen(上海罗氏制药有限公司，04913914001)。引物和miRNA模拟物及其对照均由上海生工生物工程公司设计并合成(表1)，转染试剂为锐博生物技术公司产品(Ribo-FECTCP)。

表1 所用引物和m iRNA序列表

1．4 胃腺癌组织中m iR-204-5p和HOXC8 m RNA表达的qRT-PCR检测 用Trizol裂解冻存的新鲜组织，提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度仪测定浓度。按试剂盒说明反转录，然后用SYBR Green法进行PCR，检测miR-204-5p和HOXC8 mRNA的表达，具体实验方法参见试剂盒说明书。U6为检测miR-204-5p的内参;β-actin作为HOXC8 mRNA检测的内参;表达量用2－ΔΔCt计算。

1．5 m iR-204-5p模拟物转染后SGC7901细胞中HOXC8 mRNA表达的qRT-PCR检测 SGC7901细胞接种于24孔板(2×105个/孔)，37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，培养基为含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640，第2天细胞达70%融合时进行细胞转染。转染试剂用RioFECT，按照说明书进行操作。miR-204-5p模拟物终浓度为50 nmol/L，每孔用转染试剂3μL，48 h后收集细胞进行qRT-PCR检测基因RNA表达量(实验方法同1．4)。分别用未转染和无关序列转染作为空白或无关对照组。

1．6 统计学处理 采用SPSS 21．0进行数据分析。应用非参检验(Wilcoxon)分析胃腺癌和癌旁组织中miR-204-5p和HOXC8mRNA表达水平的差异，应用t检验分析miR-204-5p模拟物转染后SGC7901细胞中HOXC8 mRNA表达的差异，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 胃腺癌中重要的ceRNA调控网络的构建 从TCGA数据库下载的胃腺癌测序数据中，剔除3个未明确显示胃腺癌诊断的病例，共得到mRNA和ln-cRNA胃癌数据374个，正常数据32个;miRNA胃癌数据443个，正常数据45个。数据合并为矩阵后，按照筛选标准，得到差异表达 lncRNA、miRNA和mRNA(图 1)，并构建了 lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络。图1显示，miR-204是重要的调控节点，其在胃腺癌中表达下调。经在线预测，miR-204-5p和HOXC8基因的3’UTR区有结合位点，两者有靶向调节关系(图2)。

图1 依据TCGA数据构建的胃腺癌lncRNA-m iRNA-m RNA的ceRNA调控网络

图2 m iR-204-5p和HOXC8靶向关系图

2．2 m iR-204-5p和HOXC8 mRNA在胃腺癌组织中的表达 与癌旁正常组织组织{［(3．24(1．20，4．44)］和［1．20(0．11，1．31)］}相比，胃腺癌组织中miR-204-5p mRNA［1．9(0．34，2．25)］低表达，而HOXC8 mRNA 高表达［3．6(2．82，6．42)］(Z=3．254和4．263，P ＜0．001)。

2．3 m iR-204-5p模拟物转染对SGC7901细胞中HOXC8 m RNA表达的影响 与无关对照组(0．955±0．137)相比，转染 miR-204-5p 模拟物的SGC7901细胞中 HOXC8 mRNA的表达(0．505±0．078)明显下调(t=2．864，P=0．046)。

3 讨论

miRNA 最早发现于 1993年［6］，在核内是由RNA聚合酶Ⅱ转录形成的转录产物(pri-miRNA)，其后在核酸酶Drosha和辅助因子DGCR8/Pasha所构成的微处理器复合体中剪切成长为60～70个核苷酸的miRNA前体(pre-miRNA)，随后再分解为miRNA。miRNA主要存在于胞浆中，通过结合到靶基因的3’UTR区;通过抑制翻译或促进mRNA降解，起到转录后调控靶基因表达的作用。可以通过生物信息学分析预测miRNA的靶向mRNA。

有文献［7-10］对TCGA数据库中的胃癌测序数据进行分析，并构建了ceRNA调控网络，发现 miR-204-5p是胃腺癌中重要的差异表达基因。

研究［2，5，11-13］显示，miR-204-5p 在胃癌中低表达，有抑癌基因的作用，对胃癌细胞上皮间质转换、侵袭和迁移有抑制作用，并促进化疗药物疗效;外周血中miR-204水平降低的胃癌患者预后较差［14］。本研究通过TCGA数据分析，发现miR-204-5p在胃腺癌中低表达，并通过检测胃腺癌患者的癌和癌旁正常黏膜组织标本验证了这一结果。

本研究通过多个数据库预测，发现HOXC8是miR-204-5p的靶基因，目前尚无文献对两者的靶向关系进行实验验证。HOXC8在多种肿瘤中高表达，作为癌基因，具有促进肿瘤转移、增殖等作用，但在胃腺癌中的作用尚不明确［15-17］。

本研究中生物信息学预测和胃腺癌组织检测结果均提示miR-204-5p和HOXC8存在ceRNA调控关系，胃腺癌中miR-204-5p表达下调可能会导致HOXC8表达上调，并通过促进癌细胞增殖、侵袭和迁移、抑制凋亡等作用机制，造成肿瘤的发生和发展。因此，本研究用miR-204-5p模拟物转染胃腺癌SGC7901细胞系，发现转染后(48 h)可明显抑制HOXC8mRNA的表达水平，其抑制效率达到50%左右。这些结果提示，miR-204-5p作为ceRNA，可能和HOXC8形成一个调节通路。另外，miR-211-5p和miR-204-5p有相同的结合靶点，但它在胃腺癌中无表达异常，该基因的功能是否和miR-204-5p有相互影响，尚需要进一步实验证实。