清胰Ⅱ号对牛磺胆酸钠诱导的急性胰腺炎大鼠的保护作用

蔡治方，彭慈军，兑丹华，傲 宇，兰天罡

遵义医学院附属医院肝胆外科贵州遵义563000

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种因胰腺消化酶异常激活引起的急性炎症性疾病［1］。研究［2-3］发现中药方剂清胰Ⅱ号可能通过多途径、多靶点对AP起到良好的治疗作用。前期研究［2］发现，减少ROS可抑制ROS/JNK信号通路的激活，下调促炎症因子的表达，减轻人体胰腺组织的损伤。该研究采用清胰Ⅱ号治疗牛磺胆酸钠诱导的AP大鼠，探讨其具体的保护作用机制，为防治AP提供参考。

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器 牛磺胆酸钠购自上海笛柏生物科技有限公司;IL-6、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)ELISA试剂盒均购自上海远慕生物科技有限公司;淀粉酶、ROS、SOD、CAT、MDA检测试剂盒为上海碧云天生物技术研究所产品;JNK检测试剂盒购自长春百奥生物科技有限公司。主要仪器有Leica DM2500显微镜、ELx800酶标仪、小型垂直电泳仪及电泳槽、全能型蛋白快速转膜仪、核酸/蛋白质含量测定仪、高速冷冻离心机。

1．2 动物分组与模型制备 清洁级6～8周龄雄性SD大鼠36只，体重(230±33)g，购于陆军军医大学实验动物中心。大鼠在无菌、室温25～27℃、湿度45%的安静空间中饲养。将36只大鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组和治疗组3组，每组12只。造模前大鼠适应性喂养7 d，术前12 h禁食，不禁水。对模型组与治疗组大鼠实施造模手术，水合氯醛麻醉，上腹切口入腹，用小动脉夹于肝门侧暂时夹闭胆管;用胰岛素注射针由十二指肠前壁斜行进针，经乳头部插入胆胰管，以0．1 mL/min的速度匀速向胆胰管内注入30 g/L牛磺胆酸钠(1 mL/kg);注药后拔出针头，关腹。麻醉苏醒后，正常组与模型组按0．01 mL/kg灌胃生理盐水，治疗组用250 g/L清胰Ⅱ号方剂按10 mL/kg灌胃，6 h一次，共灌胃4次［1］。最后一次灌胃6 h后用水合氯醛麻醉并处死大鼠，采集血液并留取胰腺、肠组织。

1．3 胰腺组织病理学观察 取胰腺组织制作切片并行HE染色，光学显微镜下观察，参照Schimidt评分标准根据水肿、腺细胞坏死、炎症和血管周围浸润情况等进行评分［1］。

1．4 血浆淀粉酶活性测定 将采集的血液及时抗凝处理后，离心机离心，取上清液。按照试剂盒说明书操作，以正常组为100%，测定模型组和治疗组的血浆淀粉酶活性。

1．5 血浆IL-6、MCP-1含量测定 参照试剂盒说明书分别测定大鼠血浆中IL-6、MCP-1含量，正常组结果记为0。

1．6 胰腺组织中ROS、SOD、CAT和MDA水平测定 取胰腺组织制成匀浆，离心后取上清，使用双氢罗丹明-123试剂盒检测ROS，用荧光强度代表ROS水平;采用氧化酶反应法检测SOD，钼酸铵终止法检测CAT，硫代巴比妥酸法检测MDA;具体方法均遵循试剂盒说明书。

1．7 肠菌检测 取3组的盲肠、回肠及结肠各1 cm，称量，用LB液态培养基冲洗肠壁，进行大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌的培养，48 h后进行细菌计数［4-6］。

1．8 胰腺组织中JNK蛋白表达的检测 取胰腺组织剪碎后，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min后，12 000 r/min离心10 min，取上清液，检测蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液混匀后，煮沸5 min，上样孔中加入40μL/孔，连接电泳仪(100 V，2 h);50 mA、4℃、半干法转膜60 min;50 g/L脱脂奶粉液室温封闭90 min，加入1∶1 000稀释的一抗，4℃孵育过夜;加入1∶2 000稀释的二抗，37℃孵育90 min。滴加显色液，曝光，激光成像系统拍照扫描，以JNK与GAPDH条带灰度值的比值表示JNK蛋白相对表达量。

1．9 统计学处理 采用SPSS 22．0进行数据分析。组间血浆淀粉酶活性及血浆中IL-6、MCP-1含量的比较采用两独立样本的t检验;胰腺组织病理学评分，胰腺组织中 ROS、SOD、CAT、MDA 水平，肠道菌群，JNK蛋白相对表达量的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 各组大鼠胰腺组织病理学观察结果 与正常组比较，模型组大鼠出现大面积胰腺组织损伤，如水肿、出血、腺细胞坏死、炎症细胞浸润等。治疗组与模型组相比，胰腺组织水肿及炎症程度皆明显减轻，炎症细胞浸润明显减少，腺细胞坏死消失。见图1。

图1 各组大鼠胰腺组织HE染色结果(×200)

2．2 各组大鼠胰腺组织病理学评分与血浆淀粉酶活性的比较 与正常组相比，模型组及治疗组大鼠组织病理学评分、血浆淀粉酶活性升高;与模型组相比，治疗组血浆淀粉酶活性下降。见表1。

表1 各组大鼠胰腺组织病理学评分与血浆淀粉酶活性的比较

2．3 各组大鼠血浆中IL-6、MCP-1含量的比较与模型组比较，治疗组血浆中IL-6、MCP-1含量降低。见表2。

表2 各组大鼠血浆中IL-6、MCP-1含量的比较 mg/L

2．4 各组大鼠胰腺组织中ROS、SOD、CAT、MDA水平比较 与正常组比较，模型组大鼠胰腺组织中ROS、MDA水平升高，SOD、CAT水平降低;与模型组比较，治疗组 ROS、MDA水平降低，SOD、CAT水平升高。见表3。

2．5 各组大鼠肠道菌群的变化 与正常组相比，模型组大鼠3种细菌数量均增加;与模型组相比，治疗组3种细菌均减少。见表4。

表3 各组胰腺组织中ROS、SOD、CAT、MDA水平比较

表4 各组大鼠肠道菌群的比较 cfu/mg

2．6 各组大鼠胰腺组织中JNK蛋白的表达 正常组、模型组、治疗组大鼠胰腺组织中JNK蛋白的相对表达量分别为(0．04 ±0．01)、(0．72 ±0．24)、(0．46 ±0．15)(F=52．848，P ＜0．001)。与正常组比较，模型组JNK蛋白表达水平增加(P＜0．05);与模型组比较，治疗组JNK蛋白表达水平降低(P＜0．05)，见图2。

图2 各组大鼠胰腺组织中JNK蛋白的表达

3 讨论

AP是严重威胁人类健康的重大疾病，随着我国民众生活节律和饮食习惯的变化，AP发病率呈现增高的趋势［7-11］。因此，寻找新的有效治疗 AP的药物，对于控制该病有着重要的临床意义。清胰Ⅱ号源自《伤寒论》，是由中医经典方大承气汤加味而成，更是由八味对症的药用植物和矿物加工而成，具有疏肝利胆、通腑泄热、缓急止痛的功效，是治疗AP的基础方剂。清胰Ⅱ号中的有效成分在AP治疗中均对应着多个不同的靶点，许多靶点又同时受到ROS/JNK基因的调控［12］。本研究结果显示:IL-6及MCP-1水平存在正常组＜治疗组＜模型组的关系，说明清胰Ⅱ号可减轻炎症反应。李敏等［13］也曾指出，清胰Ⅱ号可抑制AP小鼠的炎症反应。

研究［14］发现AP组织中氧自由基增多，表明AP发生过程中存在明显的过氧化。氧自由基可以与体内各种组织成分发生反应，影响细胞的功能和代谢，破坏细胞膜稳定性，使胰腺细胞溶酶体释放，导致组织结构被破坏，引发胰腺水肿、出血、变性和坏死。本实验结果显示:与模型组相比，治疗组胰腺组织中ROS、MDA水平明显降低，CAT、SOD水平明显升高，说明清胰Ⅱ号可提高抗氧化应激能力、清除ROS。研究［15］发现，多种促炎细胞因子可激活ROS/JNK信号转导通路，一经激活，胞浆中的JNK会迅速移位到细胞核，使其磷酸化。本实验结果显示:与模型组相比，治疗组大鼠的胰腺组织病理学评分、肠道细菌数量、血浆淀粉酶活性、JNK蛋白均明显降低，证实清胰Ⅱ号可明显缓解AP病理损伤程度。

综上所述，清胰Ⅱ号治疗后AP大鼠胰腺损伤程度减轻，说明清胰Ⅱ号可能通过减少ROS的产生抑制JNK信号通路的激活，随之阻断胰腺组织炎症因子的生成，起到拮抗AP的作用。