百合茎尖培养材料的筛选及其组培配方的优化

吴青青， 王维泽， 崔 嵬， 石乐娟， 李正丽，文林宏

(贵州省农业科学院 园艺研究所/贵州省园艺工程技术研究中心， 贵州 贵阳 550009)

百合(Liliumspp.)为百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生球根花卉，其花朵典雅对称，花色艳丽多变，深受广大消费者的喜爱，是当前世界花卉市场的主流切花产品之一，具有重要的经济价值[1-3]。世界范围内百合相关行业已经形成了庞大而复杂的产业链，荷兰依靠其在种质资源创新、杂交育种、商品球生产繁育等上游领域的垄断性技术、资源优势，获得了可观的经济利益。我国目前使用的切花百合种球主要从荷兰进口，每年进口数量超过3亿粒，并且呈逐年快速增加趋势[4-10]。随着进口种球的输入，大量百合病毒病也被传播到中国，以车前草花叶病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus,PLAMV)为例，此病毒2010年被荷兰报道在百合上发现侵染，随后即在美国、中国台湾等地检出，2018年对北京40个百合样品进行PLAMV检测，检出率为12.5%。在荷兰，车前草花叶病毒已经成为侵染百合种球的主要病毒病之一[11]。

目前，我国的切花百合病毒病发病率越来越高，1代球情况较好，2代球、3代球病毒病发病率高达80%，已成为提高百合切花品质、产量的重要障碍。最为严重的是种球国产化领域，由于未能很好地解决病毒病问题，已经严重制约了百合产业的发展[12-13]。控制病毒病的传播目前最有效的做法是种苗脱毒，较为常用的脱毒方法有茎尖培养、抗病毒药剂处理、愈伤组织脱毒及热处理等。茎尖培养是利用顶端分生组织来获得再生植株，由于顶端分生组织无毒，所以茎尖培养经常被用于种苗脱毒，是一种简单、廉价、有效的脱毒方式[14-18]。为缓解百合病毒病发病率越来越高的现状，笔者等通过比较不同来源的培养材料，筛选适宜百合茎尖培养的种源及其适宜的组培配方，旨在深入掌握百合茎尖脱毒技术，为百合脱毒苗的大批量生产提供技术支撑，以提高百合的品质与产量。

1材料与方法

1.1材料

供试品种为东方百合品种卡瓦娜(Corvara)，供试材料为卡瓦娜不同处理的组培苗与种球共3组材料。A组，未经处理的组培苗；B组，经过4℃低温处理40 d后打破休眠的组培苗；C组，商品球，经低温处理后直接栽种于基质中。供试材料均由贵州省农业科学院园艺研究所提供。

1.2方法

1.2.1适宜茎尖培养种源的筛选A、B组百合组培苗，去除外部鳞片直到裸露出内部嫩叶，在体视镜下使用刀片与解剖针将嫩叶剥去，观察茎尖。C组百合商品球，芽从基质长出后，地上部分长至10 cm左右时将芽切断，剥去嫩叶，将茎尖置于体视镜观察。通过对生长点与叶原基的观察与判断，筛选适宜脱毒茎尖培养的种源。

1.2.2百合茎尖培养基激素组合筛选使用适宜茎尖培养的B、C组材料进行试验。切0.3～0.5 mm的茎尖置于培养基上进行培养。以6-BA的3个浓度水平(0.5 mg/L、1.0 mg/L和1.5 mg/L)和NAA的2个浓度水平(0.25 mg/L和0.5 mg/L)进行6个培养基配方组合，配制培养基为：MS+6-BA+NAA+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH5.8，培养90 d后统计试验结果。B、C组材料各接种5个茎尖，3次重复。通过比较分析不同处理的培养效果，筛选适宜百合茎尖培养的培养基激素组合。

1.2.3培养基糖浓度的筛选由于60 g/L的蔗糖浓度在百合组培中有利于不定芽的生长，故以1.2.2筛选出的培养基作为基础配方(蔗糖30 g/L，CK)，提高蔗糖浓度至60 g/L，对C组材料茎尖进行培养，每个培养基各接种5个茎尖，3次重复。通过比较分析不同蔗糖浓度(蔗糖30 g/L与60 g/L)处理的培养效果，筛选适宜百合茎尖培养的培养基糖浓度。

2结果与分析

2.1适宜脱毒茎尖培养的百合种源选择

2.1.1A组材料的茎尖生长情况对A组培苗进行茎尖观察可知，其小种球直径在1 cm左右，拨开层层鳞片后，观察到靠近基盘位置的小芽(图1)，其外部被嫩叶包裹，长度为2.5 mm。拨开嫩叶后可见生长点位于底部基盘上，呈圆锥形，生长点的高度为0.2 mm左右，重复剥开几个小球茎进行观察，总体情况差别不大。从生长点情况看，未见叶原基等其他结构，可能这些分生组织尚不具备立刻发育成茎的能力，结合百合自身特点，推测这些百合鳞茎处于休眠状态。因为百合对温度敏感，在20℃以上的组培室中长时间生长会越来越趋向休眠状态，其底部基盘上不断分生出新的鳞片，但是其茎尖生长点不会向上生长。从A组茎尖的实际情况看，未经处理的组培苗不适宜作为茎尖培养的材料使用。

2.1.2B组材料的茎尖生长情况对经低温处理的组培苗进行观察，剥开鳞片后可看到2种情况。

1) 生长点与叶原基生长好，芽结构完整。小种球内的茎已经开始萌发伸长，嫩叶层层分布，其茎尖位置明显，顶端为嫩叶包裹的生长点，去掉嫩叶后即可见生长点与叶原基，芽结构完整，顶端生长点活动旺盛(图2)。说明，部分经低温处理的百合组培苗适宜进行茎尖培养，此类材料占总数的33.3%。

注：a,包裹生长点的嫩叶;b,生长点俯视图;c,生长点侧视图。

Note: a, tender leaves wrapped around the growing point; b, top view of the growing point; c, side view of the growing point.

图1A组材料的茎尖观察

Fig.1 Observation on stem tip of Group A

注： a,伸长的茎尖; b, 包裹生长点的嫩叶; c,茎尖。

Note: a, elongated stem tips; b, tender leaves wrapped around growing points; c, stem tips.

图2B组材料的茎尖观察(有叶原基的材料)

Fig.2 Shoot tip observation of group B materials (with leaf primordium)

2) 茎尖周围未见叶原基。部分组培苗顶芽并未快速生长，叶片从鳞茎包裹的中心部位长出，剥开鳞片后露出新叶基部(图3a)，去除叶片后露出柱状茎尖(图3b)，长度约1.8 mm，茎尖位置靠近基盘，类似于A组材料茎尖，只是长度有一定增加，说明其有一定的生长，茎尖周围未见叶原基。通过观察判断，这类材料茎尖分生组织不活跃，不适宜进行茎尖培养，在进一步试验中不采用此类材料。

注：a,新生嫩叶;b,裸露得茎尖;c,剥下的茎尖。

Note: a,newborn leaves; b, bare tips; c, peeled tips.

图3B组材料的茎尖观察(无叶原基的材料)

Fig.3 Stem tip observation of group B materials (without leaf primordium)

2.1.3C组材料的茎尖生长情况去除种球萌发出的芽上层层叶片，在体视镜下观察茎尖，可见最后一层小叶包裹的茎尖、生长点、叶原基等(图4)。C组材料茎尖部位明显且生长旺盛，茎尖剥离等操作难度低，说明经低温处理的百合商品球最适宜作为茎尖培养的材料。

注：a,剥开叶片的芽尖端; b,茎尖侧视图; c, 茎尖俯视图。

Note: a, bud tip of peeled leaf; b. side view of the stem tip; c, top view of the stem tip.

图4C组材料的茎尖观察

Fig.4 Stem tip observation of group C materials

2.2适宜百合茎尖培养的培养基激素组合

2.2.1成活率从表1看出，B组材料中6-BA 1.0 mg/L和1.5 mg/L与NAA 0.50 mg/L组合的培养苗成活率最高，为53.3%；C组材料中，6-BA 1.5 mg/L与NAA 0.50 mg/L组合的培养苗成活率最高，为60%。说明高浓度的6-BA与NAA有利于提高茎尖培养的幼苗成活率。

2.2.2愈伤组织6-BA 1.5 mg/L与不同浓度NAA组合，均可获得较多的愈伤组织(表1)，其中，B组材料中6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.50 mg/L获得8个愈伤组织；其次是6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L组合，获得6个愈伤组织；C组材料中，6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.50 mg/L获得9个愈伤组织，其次是6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L组合，获得8个愈伤组织。

2.2.3不定芽和成苗数从表1看出，在B组材料和C组材料中，均以6-BA 1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L组合获得的不定芽数最多，均为8个；成苗数最高，均7株。从成活率与成苗数综合看，6-BA 1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L组合配制的培养基(MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8)培养效果最好，可以用于下一步试验。

表1 不同浓度激素培养基的培养效果

2.3培养基适宜的糖浓度

在组织培养中，蔗糖作为培养基中碳与能量的主要来源，为组培苗的生长提供基础条件，多数情况下，适当提高蔗糖浓度能够促进植株的生长与发育。从表2看出，蔗糖浓度30 g/L的培养基对茎尖培养的效果略优于蔗糖浓度60 g/L的培养基。说明，较高的糖浓度未表现出对百合茎尖生长的促进作用，甚至弱于低浓度配方，从实际效果看，蔗糖浓度30 g/L更适合百合茎尖培养。因此，百合茎尖培养适宜的组培配方为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8。

表2不同糖浓度培养基效果比较

Table 2 Effects comparison of media with different sugar concentration

蔗糖浓度/(g/L)Sucrose concentration成活率/%Survival rate愈伤组织总数/个Total number of callus obtained不定芽总数/个Total number of adventitious buds成苗数/株Number of seedlings30 46.7 07760 33.3 055

3结论与讨论

研究表明，百合未经处理的组培苗、经低温处理的组培苗和商品球3组材料中，适宜进行茎尖培养的种源是经低温处理的组培苗和商品球，尤以经低温处理的商品球培养效果最佳。通过不同浓度激素和蔗糖组配试验得到百合茎尖培养的适宜激素组合及蔗糖浓度，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭1 g/L(pH 5.8)为百合茎尖培养的最适培养基。

茎尖培养是病毒病脱除中最常见的方法，具有成本低廉、操作简便等优点。当前在百合脱毒方面，为了保证脱毒效果，通常都是几种脱毒方法结合使用，比如采用热处理+茎尖培养、茎尖培养+病毒唑处理等。总体来看，其脱毒的核心是通过无毒茎尖来获得脱毒苗。茎尖脱毒的原理源自于茎尖分生组织无毒，其主要障碍在于茎尖生长点太小，其厚度不超过0.1 mm，因此难以获得且培养难度大，通常进行的茎尖培养为了方便操作都是切取顶端生长点与叶原基一起培养，这样可能造成材料依然带毒。综合看，通过彻底的顶端生长点培养可以完全解决问题，所以可以尝试进一步研究。

研究在培养基中添加了活性炭，因为在百合组织培养中活性炭在预防褐化等方面确实有一定的作用，但是其缺陷是容易造成组培苗生长缓慢，因此，在培养基中添加活性炭还需再斟酌。