CRISPR/Cas9技术编辑淀粉合成基因PUL

奉宝兵 魏祥进 焦桂爱 胡时开 邬亚文 谢黎虹 圣忠华 邵高能 唐绍清

（中国水稻研究所/农业部水稻生物学与遗传育种重点实验室/水稻生物学国家重点实验室，杭州310006；第一作者：tuopuyigou＠163.com；*通讯作者：sqtang＠126.com）

胚乳中淀粉的生物合成是通过一系列酶促反应转变成淀粉的过程，因此ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase，ADP glucose pyrophosphorylase）、淀粉合成酶（SS,starch synthase）、淀粉分支酶（SBE，starch branching enzyme）和淀粉去分支酶（DBE，debranching enzyme）被称为淀粉合成过程中的4类关键酶[1-4]。

DBE家族分为异淀粉酶亚家族ISA1、ISA2、ISA3和PUL普鲁兰酶。DBEs在淀粉的合成与降解中都具有重要作用[5-7]。在支链淀粉合成过程中，可以移除不合理分子的短链，并且将其连接到新链上，保证淀粉形成稳定的晶体结构；在种子萌发的过程中，可以特异性切割支链淀粉的α-1,6糖苷键，保证淀粉降解，促进种子发芽[8-9]。

前人对DBEs的异淀粉酶（isoamylase）研究报道很多，但对OsPUL的研究较少。FUJITA等[10]认为，OsPUL可以部分恢复isa1瘪粒突变体的表型，并报道不同突变位点与千粒重（脱壳后）既有正相关也有负相关。FUJITA等鉴定了3种不同pul等位突变体e10、i16和EM1003。对千粒重分析发现，EM1003（启动子上游1 266 bp处C替换了T）千粒重为22.42±0.29 g，比野生型（千粒重为 20.37±0.03 g）增加 10.06%；而e10（第 10个外显子内突变）和i16（第16个内含子内突变）千粒重分别为 20.12±0.02 g和 19.00±0.03 g，与野生型相比略有下降。LI等[11]报道OsPUL是胚乳特异性表达基因，在开花后15 d相对表达量最高，认为在OsPUL的启动子区存在GCN4、AACA和E2F等多个顺式作用元件。

近几年基因组编辑（Genome editing）育种迅速发展[12-13]，其主要优势是不依赖随机重组或杂交过程、可以精准诱变、易获得纯合突变。基因组编辑技术主要有三种人工核酸酶，分别是锌指核酸酶（ZFNs）、TALE核酸酶（TALENs）以及CRISPR系统[14]。中科院遗传所高彩霞课题用优化的Cas9蛋白对水稻OsBADH2、OsPDS和OsMPK2单个基因进行定点编辑，之后科研人员定点编辑了OsBadh2、OsGn1a、OsGT3、OsTGW6等重要的产量和品质相关基因[15-16]。

本研究用CRISPR/Cas9技术对调控稻米脱支酶基因OsPUL进行定点编辑，进一步探索OsPUL对淀粉合成和产量的关系，期望获得具有重要育种价值的PUL等位变异，并为分子育种提供材料基础和理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用水稻材料为粳稻品种中花11（Zhonghua 11，ZH11），以及以ZH11为转基因受体的T0代植株、T0代植株自交后代T1植株等。所有转基因材料单本移栽到转基因安全圃，中耕除草，水肥管理和病虫草害防治同大田管理。

表1 CRISPR所用引物

1.2 PUL编辑载体构建

根据CRISPR/Cas9的引物设计原理[17-18]，设计2个靶序列CRISPR-PUL-1和CRISPR-PUL-2（表1）。靶序列的引物退火成双链后，与线性化的SK-gRNA/AarI（20～50 ng）连接，构建成中间载体gRNA::PUL1和gRNA::PUL2。然后，用一步法将 gRNA::PUL1、gRNA::PUL2和pC1300-Cas9等3个载体同时线性化，利用同尾酶具有相同的粘性末端的特性，将三者连接成pC1300-Cas9::PUL1-PUL2。CRISPR/Cas9相关载体SK-gRNA和pC1300-Cas9等由中国水稻研究所王克剑课题组馈赠。

1.3 转基因阳性植株鉴定

将构建好的双靶点pC1300-Cas9::PUL1-PUL2载体通过农杆菌EHA105介导转化水稻品种ZH11成熟胚愈伤组织，T0代转基因植株经过炼苗后单本移栽转基因安全圃。分蘖期取叶片并编号，提取转基因水稻基因组DNA。用潮霉素引物HptF/R（产物750 bp）和Cas9蛋白引物Cas9-Protein F/R（产物500bp）进行PCR扩增。

同时，根据靶位点序列特征设计CAPS标记，对PCR扩增产物用内切酶酶切鉴定（PCR-RE），能被切开成两条带，说明靶位点序列没有发生突变，反之，则发生突变。此外，以ZH11和转基因植株基因组DNA为模板，CK-PUL-F1/R1和CK-PUL-F2/R2为引物分别扩增PUL基因的2个靶位点，PCR产物测序结果用SnapGene 2.32软件进行序列比对和峰图分析，鉴定转基因植株中PUL的基因型。

1.4 农艺性状考察

在田间选择同一小区里长势一致，剔除边行的植株，测定T1部分突变体的株高、穗长、剑叶长、剑叶宽，并计算这些植株的分蘖数、穗粒数、结实率。收种后烘干种子，去除瘪粒，枝梗；随机挑选饱满的种子称量千粒重，并用万深考种仪考察粒长、粒宽、长宽比等粒形性状。

1.5 稻米生理生化品质

对T0和T1两代种子进行稻米品质以下生理指标检测：总淀粉含量、直链淀粉含量、蛋白质含量、糊化温度等，每个样品测3次，取平均值进行统计分析。总淀粉含量测定采用分光光度计法，直链淀粉含量用Megazyme试剂盒（K-AMYL07/II）测定；蛋白质含量用近红外透射光谱技术测定，实验步骤参照孙成效的方法[3]。糊化温度用差示扫描仪（DSC）测定，参照 Kweon M[19]的方法。

1.6 粒重和淀粉合成相关基因表达分析

取开花后12 d的种子，立即放入液氮中，然后转入-80℃冰箱长期保存。选5粒冷冻种子进行RNA提取，参照Prescott和Marti的方法。用赛默飞公司的Nanodrop 2000检测总RNA的纯度和浓度，RNA质量合格后进行反转录。在Roche Light Cycle 480 Real-Time PCR仪上，以Ubiquitin作内参，用SYBR qPCR Mix配置反应体系，反应程序为：95℃ 30 s，95℃ 5 s/60℃ 10 s/72℃ 10 s（40 个循环），68℃ 10 min，10℃ 8 min。利用仪器自带软件进行分析，并用2-△△CT方法计算各基因的相对表达量和制作直方图。

2 结果与分析

2.1 PUL基因编辑阳性植株鉴定

为了验证PUL基因是否被成功敲除，我们首先利用CAPS引物对获得的45株T0代转基因植株进行PCR扩增及酶切检测。从图1可知，Psp1406I的酶切结果显示，转基因植株中靶位点2处有6株不能被限制酶切开，即发生突变，分别为 T0-3、T0-18、T0-21、T0-22、T0-32和T0-39。MunI酶切结果显示，转基因植株中靶位点1处有19株不能被限制酶切开，产生突变，分别为 T0-1、T0-3、T0-4、T0-7、T0-8、T0-11、T0-12、T0-15、T0-18、T0-21、T0-22、T0-25、T0-27、T0-32、T0-33、T0-36、T0-40、T0-43 和 T0-45（图 2）。综上所述，2 个靶位点处共有20株发生了基因编辑事件。

图1 Psp1406I酶切靶位点2

图2 MunI酶切验证靶位点1

图3 Sanger测序结果

PCR产物酶切结果可大致判断靶位点处是否发生突变，却不能准确判断是纯合突变还是杂合突变，以及突变类型。因此，我们对靶序列处的500 bp左右PCR产物进行测序鉴定突变类型。结果表明，T0代转基因植株中靶位点1处有11株野生型、34株突变体，突变率为75.5%；靶位点2处有21株野生型、24株突变体，突变率为53.3%。我们对上述转基因材料于成熟期单株收种，并对T0-1、T0-6、T0-11和T0-18共4个转基因系进行遗传分析。从图3可知部分T1单株的突变类型主要以单碱基的插入和单碱基的缺失为主，并造成移码突变导致氨基酸序列改变，从而影响蛋白质功能。

由考种数据可知T0-18的粒重极显著增加（图4 F），于是重点对T1-18的转基因系进行遗传分析，结果表明，敲除载体在T1-18后代中发生了分离（图5）。此外，通过对T1-18的24个单株PUL 2个靶位点进行测序分析，发现目的基因的突变位点也发生了分离（表2）。并获得了纯合单株，2个靶位点都是纯合突变用mu表示；2个靶位点存在1个杂合突变用H表示。因此，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻淀粉脱支酶家族的普鲁兰基因进行编辑，获得了pul的纯合突变体，同时还获得剔除载体骨架的遗传材料2个，分别为T1-18-10和T1-18-21（图5和表2）。

图4 相关农艺性状及PUL表达量

图5 T1-18转基因植株载体序列的分离

表2 T1-18转基因植株PUL基因型的分离

2.2 产量相关性状考察分析

为探明PUL基因突变后对产量相关性状的影响，我们对T0代突变体和野生型ZH11进行产量性状考察。

以转基因系T0-18为代表进行详细调查，在大田中可以看出T0-18的生育期比ZH11长，前者处于灌浆中期，后者处于灌前初期，生育期相差3～5 d，但是T0-18的株高和野生型没有差异（图4 A），RT-PCR结果表明，与野生型相比，T0-18植株中PUL基因的相对表达水平降低了17倍（图4 B），从RNA水平上验证了PUL基因被成功敲除。

图6 稻米品质分析结果

表3 野生型和T0-18胚乳的糊化特性

图7 T0-18的相关基因表达

RT-PCR结果表明，T0-18的PUL基因的相对表达水平，与野生型相比降低了17倍（图4 D）；从RNA水平上验证了PUL基因被成功敲除。转基因系T0-18的千粒重与对照（ZH11）相比增加10.3%（图4 F）。

粒形分析表明，T0-1、T0-6、T0-11和 T0-18株系的粒长都比ZH11增加，达到显著差异，其中T0-18的粒长（6.39 mm）比 ZH11的粒长（5.88 mm）增加 8.6%（图4 B、G）；T0-6和T0-18株系的粒宽与ZH11相比显著提高，而T0-1和T0-11株系的粒宽与ZH11无显著差异。T0-1和T0-18的长宽比均比野生型ZH11显著增加（图4 E、F、G）。此外，转基因系T0-18的千粒重与野生型ZH11相比增加10.3%（图4 F）。

2.3 稻米品质分析

普鲁兰酶主要功能是去除极限糊精中的α-1,6糖苷键，虽然普鲁兰酶的功能在玉米、水稻、小麦、拟南芥等植物中都证实有上述功能。但是，普鲁兰酶在水稻种子淀粉合成的报道还比较少。为了探讨OsPUL敲除后对稻米品质的影响，我们检测了总淀粉、直链淀粉、支链淀粉、蛋白质的相对含量（图6）和糊化温度。

相比野生型。T0转基因系的淀粉含量降低，蛋白质含量极显著增加（图6），糊化温度略低0.7℃～2.0℃（表3）。T0-11和T0-18比野生型的直链淀粉含量极显著降低，其他达到显著水平。相对而言，T0-1、T0-6、T0-11、T0-18比野生型的蛋白质含量都极显著增加。

2.4 品质及粒形相关基因表达

进一步解释敲除突变体的稻米品质变化，及粒形、粒重与野生型的差异，我们检测了品质及粒形相关基因的相对表达量。结果表明，淀粉合成相关基因和粒重相关基因在T0-18种子中的相对表达量有升有降（图7）。表达量增加的有淀粉合成酶1（SSI）、淀粉分支酶2（BE2），以及正向调控粒形和千粒重的丝氨酸羧肽酶编码基因GS5[11，20]和正向调控粒长的Gl7[21]。而粒重负调控基因 GS3[16，22]和 GW8[23]的表达量都较低。

3 讨论与结论

本文通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了PUL基因的不同等位变异植株，且获得了剔除转基因成分的纯合突变株系，为进一步利用该基因进行水稻遗传改良提供了重要材料基础。

FUJITA等[10]认为，OsPUL可以部分恢复isa1瘪粒突变体的表型，该基因还影响千粒重，此外OsPUL影响淀粉的晶体结构和淀粉含量。我们研究发现，OsPUL不仅调控淀粉合成，还影响储藏蛋白的含量。以ZH11作对照，选4个代表性的T0代植株，检测其淀粉、蛋白质和糊化温度等稻米营养指标发现，T0-18的直链淀粉含量降低了18.70%，其蛋白质含量增加了22.02%，而OsPUL敲除后对稻米外观品质无显著差异（图4 G）。

根据前人报道，在淀粉合成酶基因中，SSI有利于促进支链淀粉合成，而SSIIIa则促进支链淀粉和超长支链淀粉合成[8]。SSI表达量增加，SSIIIa表达量下降（图7），可以从侧面推测参与直链淀粉合成的酶减少，同时参与支链淀粉合成的酶增加，这与T0代稻米中直链淀粉含量降低的结果相佐证（图6）。PUL属于淀粉脱支酶（DBEs）家族基因，当pul功能缺失时，并没有像同家族的isa1（亦称sug1）突变体一样导致种子干瘪，而是形成稍许腹白，可能淀粉脱支酶家族的基因有功能冗余，ISA1可以弥补pul突变对支链淀粉合成的影响。

PUL基因编辑材料可能促进粒长增加，具有增产潜力。已有研究表明，GW8是具有SBP结构域的转录因子，可以与GL7的启动子结合，抑制其表达[21]。根据T0-18株系中粒形相关基因表达分析发现，GW8表达量下降，可导致对GL7的抑制作用减弱，从而使得GL7的表达量升高，导致粒长、粒重增加。T0-18纯合突变体千粒重增加，可能是光合产物增加，也可能是粒形粒重相关基因的表达量变化，促使千粒重增加。此外，千粒重的正调控基因GS5和GL7表达量升高，而粒形和粒重的负调控基因GW8和GS3表达量降低[16，22，24]，多个粒重相关基因形成复杂的调控网络，共同作用促进了纯合突变体的千粒重增加（图7）。