感官异常番茄酱和杏酱中腐败细菌的分离及分子生物学鉴定

巴哈提古丽·马那提拜,师 璐,李晓岩,苏 欢,张雪妮,房 芳,蒋刚强

(新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心,乌鲁木齐 830063)

0 引 言

【研究意义】果蔬罐头是蔬菜或水果等新鲜农产品经原料挑选、原料加工、罐装、密封、杀菌而制成的保藏食品[1]。新疆昼夜温差大，光照时间长、属于典型的温带大陆性气候，得天独厚的地理自然条件和水土资源非常有利于瓜果作物的生长，无论是水果还是蔬菜都有着较高的品质和营养价值，而降雨量少、空气干燥等气候条件则大大减少了植物病虫害发生[2,3]。由新疆番茄、杏等特色农产品加工制成的浓缩番茄酱、杏酱等果蔬罐头已成为新疆地区的优势产业，也是新疆出口产品的标志。近年来，凭借充足的原料、优越的地域优势和较低的生产成本，新疆特色果蔬罐头产品的出口逐年增长。伴随着产量的增长，这类产品的酸败、胀罐及色泽气味改变等问题也日益突出，而微生物是造成这些问题的主要原因[4]。【前人研究进展】曹红建等[5]采用传统培养方法，从新疆杏酱中分离得到缓慢葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、花域芽孢灰枣杆菌、短小芽孢灰枣杆菌等。吴彩兰[6]研究表明，在新疆番茄中分离得到的内生细菌中芽孢灰枣杆菌是分离频率最高，数目最多，是加工番茄内生细菌的主要优势种群。【本研究切入点】目前，新疆番茄酱和杏酱中腐败微生物的研究主要是传统培养分离及鉴定，费时费力, 以往的研究都是以胀罐胀袋的番茄酱研究为主，而一些外观正常，但感官异常的番茄酱和杏酱发生腐败不易察觉。研究采用分子生物学方法对新疆感官异常的番茄酱和杏酱中细菌进行快速鉴定。【拟解决的关键问题】通过16S rDNA序列分析并结合菌株系统发育树的方法，对感官异常的番茄酱和杏酱中腐败细菌进行鉴定，为新疆特产番茄酱和杏酱的标准化生产及其中腐败细菌防控和提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

分别选取新疆本地生产并加工的具有感官异常现象的浓缩番茄酱和杏酱罐头。

1.1.2 培养基、试剂及引物

微生物实验所需的增菌培养基和分离培养基、细菌(芽孢灰枣)染色液均购自北京陆桥技术有限责任公司。日本MGC厌氧产气袋购自青岛绿谷商贸有限公司，OMEGA总DNA提取试剂盒购自赛默飞生物科技有限公司。PCR所用PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye)购自天翼沣生物科技有限公司。所用的培养基和试剂都在有效期内按要求配制、灭菌使用。所用的16S引物序列(5’-3’)为F-AACTGGAGGAAGGTGGGGA和R-AGGAGGTGATCCAACCGCA，引物的合成及测序工作由天翼沣生物科技有限公司完成。

1.1.3 仪器设备

细菌的增菌、分离和鉴定工作在百级无菌实验室或NU-425-400E 生物安全柜里进行。试验所用的其他仪器设备包括：pH计、电子天平、厌氧工作站、细菌培养箱、恒温摇床、水浴锅、高压灭菌器、拍击式均质器、离心机、通用凝胶成像系统、PCR仪，Vitek 2全自动微生物鉴定仪等仪器设备都通过技术性验收或计量确认，均运转正常。

1.2 方 法

1.2.1 培养基

参照吴海文等[7](2006)、黄忠梅等[8](2007)和曹红建等[5](2013)对培养基筛选结果，分别选取脑心浸出肉汤和营养肉汤及脑心浸出琼脂和营养琼脂进行增菌和分离培养。

1.2.2 感官评定和pH值的测定

取出适量的罐头样品在白色托盘里进行感官检测(与同一批正常的样品进行比较)。准确称取果蔬罐头5 g至等量的无菌水稀释，随后用pH仪进行反应溶液的pH测定。

1.2.3 培养条件和时间

准确称取25 g异常样品至盛有225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，拍打1～2 min，制成1∶10 的样品匀液，将此匀液进行10倍比稀释，稀释至10-7备用。取各稀释度匀液1 mL置于脑心浸出肉汤和营养肉汤中，将培养物放置36℃培养箱进行培养，每24 h取上述培养物一环，接种至脑心浸出琼脂和营养琼脂后放置36℃条件下恒温培养，共培养96 h(其中需厌氧培养的样品在厌氧工作站中称取后装至厌氧罐使用厌氧产气袋进行增菌和分离培养)。

1.2.4 DNA提取

待分离培养基上有明显菌落生长，挑取单菌落于脑心浸出肉汤中，在恒温摇床培养24 h后进行菌株总DNA的提取。具体提取方法参照细菌DNA提取试剂盒说明书进行。

1.2.5 PCR扩增反应

研究的PCR反应体系如下表所示。表1

表1 PCR反应体系
Table1 Reaction system of PCR

成分Component体积VolumePremix TaqTM10 μL引物1(10 μmol/L)1 μL引物2(10 μmol/L)1 μL模板DNA1 μL加无菌水至总体系20 μL

研究的PCR反应程序如下图所示。图1

1.2.6 菌株测序及系统发育树的构建

测序和发育树的构建：将分离所得菌株利用16S rDNA 引物进行PCR扩增，扩增得到的PCR产物进行16S rDNA的测序与分析，测序工作由英潍捷基生物有限公司完成。将所得序列在GenBank数据库中经BLAST比对，并对菌株进行同源性分析，根据相似性最高的序列推测待鉴定菌株可能的分类地位。经分析软件Clustal X 1.815比对后，通过MEGA 5.1采用邻近法绘制相关菌株的系统发育树[9,10]。

1.2.7 菌株的生化鉴定

菌株的生化鉴定使用Vitek 2全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

注：“退火温度根据引物的Tm值变动，延伸时间根据扩增目的的片段大小调整

图1 PCR反应程序
Fig.1 Reaction procedure of PCR

2 结果与分析

2.1 感官评定和pH值测定

研究表明，异常的浓缩番茄酱和杏酱味道、色泽、组织结构等感官指标均有不同程度的变化。番茄酱和杏酱的pH值均低于4.6，属于酸性罐藏食品，异常的番茄酱和杏酱的pH值均有降低的趋势。表2

表2 感官评定结果和pH值
Table 2 Sensory evaluation results and pH value measurement results

项目Items状态Status番茄酱Canned tomato杏酱Apricot jam香味正常轻微的香味明显的香味异常轻微或明显的酸味明显的刺激酸味色泽正常鲜红色,纯正柔和鲜黄色异常黑红、淡红或橘黄色不柔和深黄色滋味正常风味好,酸度适中微酸、口感佳异常较酸、口感较差(苦)口感极差、苦酸组织正常均匀、粘稠适中均匀、细腻异常不均匀、粗糙不均匀、粗糙pH值正常4.263.67异常4.143.48

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌株分离筛选及生化鉴定

感官异常番茄酱和杏酱中的菌株分离筛选按照1.2的方法进行。分离得到9株菌株经Vitek 2全自动微生物鉴定仪鉴定为甲基营养性芽孢灰枣杆菌、枯草芽孢灰枣杆菌、地衣芽孢灰枣杆菌、沃氏葡萄球菌、粪链球菌、巴氏葡萄球菌、粪肠球菌、类芽孢灰枣杆菌。表3

表3 浓缩番茄酱和杏酱中鉴定的细菌类型
Table 3 Identified bacterial types in concentrated tomato and apricot sauce

样品名称Sample name菌株类型Strain type番茄酱Canned tomato甲基营养性芽孢灰枣杆菌(Bacillus methylotrophicus)枯草芽孢灰枣杆菌(Bacillus subs)地衣芽孢灰枣杆菌(Bacillus licheniformis)沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)粪链球菌(Enterococcus faecium)杏酱Apricot jam巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)粪肠球菌(Enterococcus faecium)沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)类芽孢灰枣杆菌 (Paenibacillus cookii sp.)

2.2.2 菌株总DNA提取

分离培养基上有明显菌落生长后挑取单菌落于BHI肉汤中，在恒温摇床培养24 h(厌氧或微需氧条件下分离的菌株采用厌氧或微需氧产气袋在厌氧罐中培养)后进行菌株总DNA的提取，其中分离提取得到9株菌株，将所得菌株序列提交至NCBI进行BLAST比对后进行系统发育树的构建。图2

注：M: DL5 000 Marker (5 000 bp, 3 000 bp, 2 000 bp, 1 500 bp, 1 000 bp, 750 bp)泳道1至9：S-1至S-9的PCR扩增；泳道10 阳性对照；泳道11 空白对照；

Note:Lane1 to Lane 9: PCR product of S-1 to S-9 (1,500 bp); Lane 10: Positive control；Lane11: Blank control;

图2 细菌总DNA提取PCR电泳图
Fig. 2 PCR electrophoresis extracted from total bacterial DNA

2.2.3 菌株系统发育树构建

菌株系统发育树的构建按照1.2.6的方法进行，鉴定的菌株分别有甲基营养性芽孢灰枣杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、枯草芽孢灰枣杆菌(Bacillussubtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)、地衣芽孢灰枣杆菌(Bacilluslicheniformis)、类芽孢灰枣杆菌(Paenibacilluscookiistrain)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)，构建的发育树。图3

3 讨 论

一般罐头食品败坏的发生率很低，往往是原料选择和加工不当，灭菌不充分和包装过程不严实等原因导致产品产气、酸败、胀罐及色泽气味的改变[11]，威胁消费者的身体健康及生命安全。研究对新疆特色果蔬罐头浓缩番茄酱和杏酱进行了感官评定、细菌的分离及分子生物学鉴定。按照pH的检测结果，浓缩番茄酱和杏酱的pH值均<4.6，属于酸性罐藏食品，且出现腐败现象的感官评定异常罐头的pH值低于正常罐头，这可能与罐头中的腐败菌有一定的关系。据报道罐藏食品中的球菌能分解糖类产酸，导致该类食品的pH降低[7]。

采用细菌总DNA提取并对PCR产物进行扩增与测序，再对测序结果进行进化关系分析最终得到分离的9株细菌，分别为芽孢灰枣杆菌类(甲基营养性芽孢灰枣杆菌、类芽孢灰枣杆菌、地衣芽孢灰枣杆菌、枯草芽孢灰枣杆菌)和肠球菌类(沃氏葡萄球菌、粪肠球菌、巴氏葡萄球菌)。浓缩番茄酱中鉴定的芽孢灰枣菌为甲基营养性芽孢灰枣杆菌、枯草芽孢灰枣杆菌、地衣芽孢灰枣杆菌，球菌类有沃氏葡萄球菌、粪肠球菌。其中，地衣芽孢灰枣杆菌和沃氏葡萄球菌是兼性厌氧获得菌。这些结果与黄忠梅等[8]番茄酱中检出的20 株菌分别为埃希氏菌属、棒状杆菌属、芽孢灰枣杆菌属、葡萄球菌属等, 均为兼性厌氧菌基本吻合。芽孢灰枣杆菌具有代谢快、繁殖快和生长能力强等特点，最快4 h增殖10万倍，并且体积比一般病原菌分子大4倍数，相比之下占据空间优势，抑制病原菌生长[12]。

研究在杏酱中分离鉴定的细菌以球菌为主包括巴氏葡萄球菌、粪肠球菌、沃氏葡萄球菌。其中巴氏葡萄球菌为厌氧培养获得。芽孢灰枣杆菌只有一种为类芽孢灰枣杆菌，可能与杏酱较低的酸度有关系。有研究表明，芽抱杆菌耐酸能力较低，酸度高的罐藏食品中基本无法存活，但酸性罐头食品中发现有芽抱杆菌的存在，可能是杀菌不彻底或有漏罐现象[7]。曹红建等[5]在新疆杏酱中分离得到缓慢葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、花域芽孢灰枣杆菌、短小芽孢杆菌等。粪肠球菌和沃氏葡萄球菌是新疆番茄酱和杏酱中共同存在的球菌。

图3 菌株系统发育树
Fig. 3 The strain phylogenetic tree

4 结 论

通过分子生物学方法对感官异常的浓缩番茄酱和杏酱中的腐败细菌进行鉴定，结果表明，番茄酱中分离获得的细菌以芽孢菌为主，杏酱中的细菌以球菌为主，其中沃氏葡萄球菌和粪肠球菌是这两类酱产品的共有菌种，在番茄酱和杏酱的加工生产中应加强防范此类微生物。分子生物学方法鉴定感官异常番茄酱和杏酱中的细菌快速准确，鉴定结果与生化鉴定结果一致。