长链非编码RNA DNM3OS在胃癌中的研究

刘 莹 陈兴银 谭 婷 刘长青 汤顺玉 李 响

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，是全球三大癌症死亡原因。胃癌在全球的发生率因地区而异，在东亚其发生率最高[1, 2]。大多数患者首诊时即发现在癌症晚期，已经出现了转移。尽管近年来在外科技术和放、化疗方面取得了较大进展，然而晚期胃癌患者预后仍不理想[3]。因此，充分了解胃癌发展的潜在分子机制，寻找新的诊断标志物和发掘新的肿瘤侵袭转移的治疗靶点迫在眉睫。

长链非编码RNA(LncRNA)是一类超过200个核苷酸的转录物质，其没有编码蛋白的潜能，但是多数研究表明LncRNA在肿瘤的发生、发展中发挥关键作用。LncRNA参与多种肿瘤生物学作用，包括肿瘤增殖、侵袭、转移、凋亡和化疗药物的抵抗[4]。研究表明LncRNA的失调在诱导胃癌的发生和转移中发挥重要作用[5]。DNM3OS是一种新发现的LncRNA，前期研究报道其在卵巢癌中通过诱导上皮向间质转化促进卵巢癌的侵袭，降低其生存率。然而其在胃癌中的作用尚无报道。本研究旨在探讨DNM3OS在胃癌患者中的表达及其与胃癌患者预后的关系，探讨DNM3OS对胃癌细胞系的作用和机制，为胃癌的防治提供新的理论基础。

材料与方法

1.患者样本:肿瘤及其癌旁组织来源于2012年1月～2016年1月在笔者医院接受手术的胃癌患者。研究方案经笔者医院伦理学委员会批准。所有参与者均知情同意。所有患者在手术前均未接受放疗或化疗。所有胃癌组织标本均取后立即快速冷冻在-80℃下储存。采用电话随访的方式进行随访，每半年1次，询问患者再入院情况和死亡情况。

2.细胞培养和转染:人胃上皮细胞系AGS和 MKN45(上海中国科学院细胞库)在含有10%胎牛血清(美国Sigma公司)的RPMI-1640培养基中培养。细胞转染：将2×105个细胞接种到6孔板中，用脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)进行细胞转染。siRNA序列如下：si-DNM3OS: 5′-CAACTAGTGTTCAACTATA-3′。

3.RT-PCR检测：提取胃癌组织和细胞的总RNA，用反转录酶XL(日本TaKaRa公司)、寡核苷酸和随机引物将1μg总RNA反转录为cDNA。采用QuantStudio 5 real-time PCR 系统(美国Thermo fisher公司)以及SYBR green反应试剂盒(美国Biosystems公司)进行PCR扩增反应，以肌动蛋白β(β-actin)作为内参。

4.免疫印迹法:提取胃癌组织和细胞的总蛋白，采用裂解液裂解蛋白后离心取上清总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，采用10%是SDS-page进行凝胶电泳，将蛋白转移到PVGF膜上，采用5%脱脂牛奶封闭30min，采用相应的一抗孵育过夜，采用荧光二抗孵育1h，采用Odessey 红外系统进行显色，所有蛋白与内参β-actin进行比较。

5.MTT试剂盒检测细胞增殖:细胞接种于96孔板中，处理完毕后每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。用PBS冲2～3遍后，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪A490nm处测量各孔的吸光度值。

6.凋亡染色检测：采用Tunel染色检测凋亡阳性细胞数量，处理好的细胞采用4%多聚甲醛固定15min，用预冷的乙醇和冰醋酸1∶1溶液后固定，采用0.2% TritonX 200通透细胞5min，孵育TUNEL反应混合液1h，采用DAPI染色细胞核。以每个视野下绿色和蓝色细胞核重叠百分数作为细胞凋亡百分数。

结 果

1.DNM3OS在胃癌组织和细胞中表达升高:RT-PCT结果显示，与癌旁组织比较，DNM3OS在胃癌组织中的表达显著升高(P<0.05)；与正常细胞比较，AGS细胞系中DNM3OS的表达显著增高(P<0.05)；与正常细胞比较，MKN45细胞系中DNM3OS的表达显著增高(P<0.05)，详见图1。

图1 DNM3OS在胃癌组织和细胞中表达升高

2.DNM3OS表达与胃癌患者肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分级相关性:纳入的50例患者，以DNM3OS表达的中位数为界限，将其分为DNM3OS高表达组，DNM3OS低表达组，两组患者的肿瘤组织分化程度、Bormann分型、肿瘤直径和神经侵犯率、血管侵犯率比较，差异无统计学意义，而T分级、N分级和TNM分级差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

3.DNM3OS表达与胃癌患者生存率的关系:随访患者36个月，统计患者病死率，DNM3OS高表达组患者死亡15例，病死率高达50%，而DNM3OS低表达组患者死亡4例，病死率为20%，两组存活率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，生存率曲线详见图2。

4.DNM3OS沉默减少胃癌AGS细胞系的增殖，增加其凋亡：培养胃癌AGS细胞系，采用siRNA沉默DNM3OS的表达后其表达明显低于对照组(P<0.05)，证明siRNA的转染是成功的。MTT试验结果显示，在培养12、24、48和72h，对照组AGS细胞不断增殖，而DNM3OS沉默组(si-DNM3OS)细胞增殖明显低于对照组(P<0.05)，详见图3B。采用Tunel染色检测细胞凋亡水平，对照组细胞凋亡率为5.6%±1.2%，DNM3OS沉默组细胞凋亡率为29.7%±4.5%，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图3C。

表1 DNM3OS的表达与胃癌患者肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分级的关系

图2 DNM3OS表达与胃癌患者生存率的关系两组比较，*P<0.05

5.DNM3OS沉默减少胃癌MKN45细胞系的增殖，增加其凋亡：培养胃癌MKN45细胞系，采用siRNA沉默DNM3OS的表达后其表达明显低于对照组(P<0.05)，证明siRNA的转染是成功的(图4A)。MTT试验结果显示，在培养12、24、48和72h，对照组MKN45细胞不断增殖，而DNM3OS沉默组(si-DNM3OS)细胞增殖明显低于对照组(P<0.05，图4B)。采用Tunel染色检测细胞凋亡水平，结果显示,

图3 DNM3OS沉默减少胃癌AGS细胞系的增殖，增加其凋亡C.绿色为凋亡细胞，蓝色为细胞核(×400);与siRNA对照组比较，*P<0.05

图4 DNM3OS沉默减少胃癌MKN45细胞系的增殖，增加其凋亡C.绿色为凋亡细胞，蓝色为细胞核(×400);与siRNA对照组比较，*P<0.05

对照组细胞凋亡率为54.6%±1.9%，DNM3OS沉默组细胞凋亡率为30.7%±3.8%，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05，图4C)。

6.DNM3OS 调控Akt信号分子：免疫印迹法检测结果显示，在AGS细胞系中，DNM3OS沉默组Akt的磷酸化水平明显低于对照组(P<0.05，图5A)；在MKN45细胞系，DNM3OS沉默组Akt的磷酸化水平同样明显低于对照组(P<0.05，图5B)。

图5 DNM3OS 调控Akt信号分子

讨 论

研究表明LncRNAs在肿瘤的各种生命过程中发挥关键作用，这表明其可以作为判断肿瘤预后的分子标志物和治疗靶点[6,7]。目前为止，多数研究发现在胃癌组织中多种LncRNA表达失调，包括GCLNC1、PANDAR、MALAT1、GCRL1[8～10]。本研究发现与相邻正常组织比较,LncRNA DNM3OS在胃癌组织中显著上调。且DNM3OS高表达的患者肿瘤侵袭、淋巴结转移、TNM分期明显差于DNM3OS低表达患者。DNM3OS高表达患者的生存率也低于预后DNM3OS低表达患者。这些结果表明，DNM3OS可能是作为潜在的胃癌预后判断的生物学标志物。为了进一步评估DNM3OS在胃癌细胞发展中的作用，笔者采用DNM3OS siRNA对两种胃癌细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，DNM3OS沉默抑制了胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞的凋亡。这些结果表明DNM3OS在胃癌细胞中发挥肿瘤促进作用。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[11]。Akt是Akt/PI3K/PTEN信号通路中的关键蛋白。Akt一旦被磷酸化激活，在恶性转化过程中起着重要作用[11,12]。磷酸化Akt(P-Akt)通过激活下游的哺乳动物雷帕霉素干扰细胞凋亡、促进细胞增殖和运动[13]。过度表达的P-Akt被认为是许多恶性肿瘤预后不良的重要指标[14～16]。一项Meta分析表明，P-Akt高表达与乳腺癌患者的总体生存率差显著相关[17]。P-Akt表达升高与非小细胞肺癌患者生存率低显著相关[18]。此外，P-Akt表达升高与胃癌患者预后差明显相关[19]。而本研究发现，在DNM3OS沉默后AGS胃癌细胞系和MKN45胃癌细胞系中Akt的激活明显下调，提示DNM3OS可能通过上调Akt促进胃癌细胞的增殖，抑制其凋亡发挥促胃癌发生、发展的作用。

综上所述，DNM3OS在胃癌中高表达，其可能作为新的生物学标志物用于判断胃癌患者的预后；DNM3OS可能通过促进Akt的活化促进胃癌细胞的生存和进展。本研究为胃癌治疗提供了新思路，未来基于DNM3OS为靶点的新药物可能成为治疗胃癌的新策略。