黄芩苷联合小檗碱干预非酒精性脂肪性肝炎两种动物模型的病理学研究

续畅 马致洁 黄凤 钟晓松

[摘要] 目的 从病理学的角度探讨黄芩苷联合小檗碱对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）两种动物模型的干预作用。 方法 选用6周龄SD大鼠及C57BL/6小鼠各40只，按随机数字表法各分为4组：正常对照组、NASH模型组、小檗碱组、黄芩苷+小檗碱组，每组10只。除正常对照组外，其他三组分别制备高脂饮食诱导的SD大鼠NASH模型及蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的C57BL/6小鼠NASH模型，小檗碱组造模的同时灌胃给予小檗碱，黄芩苷+小檗碱组造模的同时灌胃给予黄芩苷及小檗碱，大鼠持续8周后取材，小鼠持续2周后取材。肝组织制成石蜡切片进行HE染色，制成冰冻切片进行油红O染色，经光镜观察摄片后，采用非酒精性脂肪性肝病活动度积分表（NAS）对各组进行NASH评估。 结果 两种动物模型的NASH模型组肝脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均显著高于正常对照组（P < 0.01）。两种动物模型的小檗碱组、黄芩苷+小檗碱组肝脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均显著低于NASH模型组（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 黄芩苷及小檗碱可显著抑制NASH相关病理变化的发生、发展，对NASH具有一定的干预作用。

[关键词] 黄芩苷;小檗碱;非酒精性脂肪性肝炎;大鼠;小鼠;病理学

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）08（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Baicalin combined with Berberine on non-alcoholic steatohepatitis （NASH） in two animal models from the pathological point of view. Methods 40 SD rats and 40 C57BL/6 mice aged 6 weeks were divided into four groups according to random number table method： normal control group， NASH model group， Berberine group， Baicalin + Berberine group， 10 rats （or mice） in each group. In addition to normal control group， the other three groups prepared SD rats NASH model induced by high fat diet and C57BL/6 mice NASH model induced by methionine-choline deficiency diet. Berberine group was given Berberine by gavage， Baicalin + Berberine group was given Baicalin and Berberine by gavage. The rats were taken after 8 weeks， and the mice were taken after 2 weeks. Paraffin sections of liver tissue were stained with HE， frozen sections were stained with oil red O. After light microscopy， non-alcoholic fatty liver disease activity scale （NAS） was used to evaluate NASH in each group. Results The scores of hepatic steatosis， intralobular inflammation， hepatocyte balloon-like degeneration and total NAS in NASH model group were significantly higher than those in normal control group of two animal models （P < 0.01）. The scores of hepatic steatosis， intralobular inflammation， hepatocyte balloon-like degeneration and NAS in Berberine group and Baicalin + Berberine group were significantly lower than those in NASH model group of two animal models （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Baicalin and Berberine can significantly inhibit the occurrence and development of pathological changes in NASH. They have certain intervention effect on NASH.

[Key words] Baicalin; Berberine; Non-alcoholic steatohepatitis; Rats; Mice; Pathology

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是指無过量饮酒史，以肝实质细胞大泡性脂肪病变及脂肪贮积为病理特征，并伴随肝小叶弥漫性炎症及肝窦、中央静脉周围胶原沉积的临床综合征[1]。据相关临床研究显示，NASH是单纯性脂肪肝向肝硬化、肝纤维化、肝衰竭转化的重要环节，是隐源性肝硬化的关键病因之一[2-3]，且NASH与糖尿病、高脂血症、肥胖同属代谢综合征，并常常相互转化[4]，因此NASH的潜在患者数量是巨大的，探索防治NASH的多靶点药物已成为目前迫在眉睫的工作。本课题组采用两种动物模型，从病理学的角度对小檗碱及黄芩苷联合小檗碱治疗NASH的效果进行评价，以期为NASH的防治工作提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验所用的SD大鼠及C57BL/6小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，实验动物合格证号：大鼠11400700375241/小鼠11400700376164]。实验的动物饲养、造模、给药、取材方案均报备首都医科大学附属北京友谊医院科研伦理委员会并获批后，饲养于SPF级动物房的独立通气笼具系统（IVC）中，每笼5只，均为6周龄。

1.2 药品与试剂

盐酸小檗碱片（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：101201）;黄芩苷胶囊（东莞市金美济药业有限公司，批号：1714113）;大鼠维持饲料、大鼠高脂饲料、小鼠蛋氨酸-胆碱缺乏饲料（MCD）[5]、小鼠蛋氨酸-胆碱充足饲料（MCS）均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.3 实验仪器

RM2235型轮状切片机，德国徕卡（Leica）;XPE105电子天平，瑞士梅特勒-托利多（Mettler Toledo）;ST40R高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔（Thermo Fisher）;DW-86L729-86℃超低温保存箱，中国海尔;DM3000正置显微镜，德国徕卡（Leica）;CamERC5s照相系统，德国蔡司（Zeiss）。

1.4 动物分组、造模与给药

1.4.1 高脂饮食诱发的NASH模型  根据课题组前期研究成果[6]，将SD雄性大鼠40只（120±5）g根据随机数字表法分为4组：正常对照组、NASH模型组、小檗碱组（按人与大鼠的公斤体重剂量换算公式折算，90.32 mg/kg）、黄芩苷+小檗碱组（按人与大鼠的公斤体重剂量换算公式折算，150.62 mg/kg+90.32 mg/kg），每组10只。所有SD大鼠经适应性喂养7 d后，正常对照组饲喂维持饲料，其他三组均饲喂高脂饲料，共持续8周。实验采用干预给药方式：小檗碱组及黄芩苷+小檗碱组每日上午灌胃给药1次，正常对照组及NASH模型组经灌胃给予同体积的生理盐水。各组大鼠自由进食、饮水，每日观察大鼠的活动、毛发、二便等情况。第8周实验结束后，所有大鼠禁食不禁水24 h，称重、麻醉（10%水合氯醛，0.04 mL/kg）、解剖并取相同部位的肝组织（1 cm×1 cm）2块，一块由4%多聚甲醛固定用以制作石蜡切片，另一块由OCT包埋用以制作冰冻切片。

1.4.2 蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱发的NASH模型  根据课题组前期研究成果[6]，C57BL/6雄性小鼠40只（25±5）g根据随机数字表法分为4组：正常对照组、NASH模型组、小檗碱组（按人与小鼠的公斤体重剂量换算公式折算，129.78 mg/kg）、黄芩苷+小檗碱组（按人与小鼠的公斤体重剂量换算公式折算，216.34 mg/kg+129.78 mg/kg），每组10只。所有C57BL/6小鼠经适应性喂养7 d后，正常对照组饲喂MCS饲料，其他三组均饲喂MCD饲料，共持续2周。实验小鼠给药途径、饲养、观察、取材等步骤同“1.4.1”。

1.5 病理学检测

经4%多聚甲醛固定的肝组织，进行常规的石蜡包埋与切片（4 μm），制成石蜡切片后进行HE染色，由光学显微镜观察并摄片;经OCT包埋的肝组织，制成冰冻切片（10 μm）并进行油红O染色，由光学显微镜观察并摄片。NASH的病理诊断标准采用由美国国立卫生研究院（NIH）于2005年制订的非酒精性脂肪性肝病活动度积分表（NAS）[7]进行计算评估。NAS评估系统对NASH的3项病理指标、14项病理改变进行综合评估计分。见表1。

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，对正态分布、方差齐的数据采用单因素方差分析;对正态分布但方差不齐的数据采用Welch检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝組织石蜡切片HE染色结果

正常对照组大鼠及小鼠肝组织着色较为均匀，肝细胞结构完整清晰，沿中央静脉周围呈放射状排列;NASH模型组大鼠及小鼠肝组织结构紊乱，发生大面积的脂肪样变，中央静脉周围肝细胞空泡化严重，可见多个炎症病灶;小檗碱组大鼠及小鼠肝组织脂肪变性减轻，肝细胞基本呈放射状排列，炎症病灶减少;黄芩苷+小檗碱组大鼠及小鼠肝组织脂肪变性明显减轻，大部分肝细胞呈放射状排列且空泡化明显减轻，炎症细胞浸润减少。见图1。

2.2 肝组织冰冻切片油红O染色结果

正常对照组大鼠及小鼠肝组织着色较浅或不着色;NASH模型组大鼠及小鼠肝组织中出现了大量脂滴;小檗碱组、黄芩苷+小檗碱组的大鼠及小鼠肝组织中的脂滴明显减少并呈不均匀分布。见图2。

2.3 NAS组织学评分

2.3.1 SD大鼠NAS组织学评分  高脂饮食诱导的NASH大鼠模型中，正常对照组的NAS总分<3分，NASH模型组的NAS总分≥ 5分，可明确诊断为NASH，NASH造模成功;小檗碱组的NAS总分为3～<5分，处于NASH可能阶段;黄芩苷+小檗碱组的NAS总分<3分，可排除NASH。NASH模型组大鼠的肝脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均显著高于正常对照组（P < 0.01）。小檗碱组、黄芩苷+小檗碱组大鼠的肝脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均显著低于NASH模型组（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.3.2 C57BL/6小鼠NAS组织学评分  蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的NASH小鼠模型中，正常对照组的NAS总分<3分，NASH模型组的NAS总分≥5分，可明确诊断为NASH，NASH造模成功;小檗碱组的NAS总分为3～<5分，处于NASH可能阶段;黄芩苷+小檗碱组的NAS总分<3分，可排除NASH。NASH模型组小鼠的肝脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均显著高于正常对照组（P < 0.01）。小檗碱组、黄芩苷+小檗碱组小鼠的肝脂肪变、小叶内炎症、肝细胞气球样变评分及NAS总分均显著低于NASH模型组（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

有研究显示，小檗碱可显著降低2型糖尿病患者的空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2 h PG）及糖化血红蛋白（HbA1c），且其作用机制为抑制胰岛素抵抗的发生、发展[8-10]。因此，小檗碱对与同属代谢综合征的NASH而言，理应具有治疗效果，且本课题组通过Meta分析等循证医学方法，也从临床角度证实了小檗碱治疗NASH确有其效[11]。而黄芩苷在临床中主要用于辅助治疗急性肝炎、慢性肝炎、迁延性肝炎等肝脏疾病[12-18]，但针对黄芩苷治疗NASH等非酒精性脂肪性肝病方面的研究却鲜有报道。

本课题组前期研究显示，葛根芩连汤对NASH具有良好的治疗效果[19-20]。葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连、甘草四味中药组成，其中葛根的主要有效成分葛根素、黄连的主要有效成分小檗碱对NASH的有效性已被本课题组证实，而黄芩的主要有效成分黄芩苷对NASH的作用尚待研究。为此，本课题组采用高脂饮食诱发的NASH大鼠模型、蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱发的NASH小鼠模型，从病理学的角度，对小檗碱、黄芩苷联合小檗碱治疗NASH的效果进行评价。本实验结果显示，小檗碱、黄芩苷联合小檗碱均可减轻两种NASH动物模型肝脏的脂肪变性，抑制肝细胞空泡化的发生，减少肝小叶内炎症病灶的数量，其中黄芩苷联合小檗碱对NASH的疗效优于单独使用小檗碱，经黄芩苷联合小檗碱干预的两种NASH动物模型可维持基本正常、完整的肝组织结构，肝细胞沿中央静脉周围呈放射状排列。

综上所述，小檗碱、黄芩苷联合小檗碱均对两种NASH动物模型具有良好的疗效。今后，本课题组将从药效学、血清学、分子生物学的角度进一步探索小檗碱及黄芩苷治疗NASH的效能与机制，从而为防治NASH提供新的思路。

[参考文献]

[1]  European Association for the Study of the Liver（EASL），European Association for the Study of Diabetes（EASD），European Association for the Study of Obesity（EASO）. EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the management of non-alcoholic fatty liver disease [J]. Diabetologia，2016，59（6）：1121-1140.

[2]  Eslam M，George J. Genetic and epigenetic mechanisms of NASH [J]. Hepatol Int，2016，10（3）：394-406.

[3]  Laish I，Mannasse-Green B，Hadary R，et al. Telomere dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease and cryptogenic cirrhosis [J]. Cytogenet Genome Res，2016，150（2）：93-99.

[4]  Chow MD，Lee YH，Guo GL. The role of bile acids in nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis [J]. Mol Aspects Med，2017，56（1）：34-44.

[5]  Lee GS，Yan JS，Ng RK，et al. Polyunsaturated fat in the methionine-choline-deficient diet influences hepatic inflammation but not hepatocellular injury [J]. J Lipid Res，2007，48（8）：1885-1896.

[6]  續畅，刘泽洲，许可嘉，等.高脂及MCD饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎动物模型的比较[J].现代生物医学进展，2014，14（18）：3451-3455.

[7]  Kleiner DE，Brunt EM，Van Natta M，et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease [J]. Hepatology，2005，41（6）：1313-1321.